Effetto di componenti del microambiente sulla modulazione del fenotipo e sull'espressione genica di cellule umane in coltura

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Il presente progetto di ricerca rappresenta una continuazione di quello condotto negli anni precedenti, ed è focalizzato sullo studio del ruolo di alcune componenti del microambiente colturale come collagene tipo V, cadmio/manganese, micotossine e frammenti biologicamente attivi della "parathyroid hormone-related protein" (PTHrP) sulla modulazione del fenotipo e sull'espressione genica di cellule di carcinoma mammario umano in coltura e di epitelio mammario non tumorale ma "immortalizzate". In particolare lo studio sarà focalizzato sull'effetto dei trattamenti sull'attività proliferativa ed invasiva delle cellule e sull'individuazione di geni differenzialmente espressi in risposta alla somministrazione dei diversi fattori nel microambiente, tramite esperimenti di "differential display"- e "semi-quantitative multiplex" PCR. Esperimenti relativi alla ricerca di marcatori di differenziamento tramite tecniche di PCR saranno inoltre condotti su cellule staminali mesenchimali adulte indotte al differenziamento adipocitario e/o osteoblastico.

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Gli obiettivi del progetto proposto riguardano l'approfondimento di studi già in corso da alcuni anni sull'effetto delle interazioni tra cellule umane mammarie tumorali o immortalizzate e i)il frammento centrale del PTHrP, ii) substrati di molecole della matrice extracellulare (ad es. il collagene tipo V), iii) metalli pesanti e micronutrienti usati individualmente ed in co-trattamento(ad es. cadmio e manganese). Le cellule umane mammarie tumorali ed immortalizzate saranno inoltre usate come modello di studio per la valutazione del potenziale effetto citotossico su di esse esercitato da differenti tipi di micotossine di interesse commerciale (in collaborazione con il Dr. I.H. Evans dell'Università di Greenwich, UK). In parallelo, in collaborazione con la Prof. E. Tobiasch (Fachhochcschule Bonn-Rhein-Sieg, D) saranno identificati marcatori del differenziamento in senso osteoblastico ed adipocitario di cellule staminali mesenchimali adulte in coltura ottenute da diversi donatori a seguito di interventi di liposuzione. RNA totale e/o messaggero sarà estratto da cellule controllo e trattate con PTHrP [38-94], micotossine, cloruro di cadmio in co-trattamento con cloruro di manganese, o coltivate su substrati di collagene tipo V, e verrà sottoposto a retro-trascrizione. Le preparazioni di cDNA ottenute saranno sottoposte ad analisi tramite PCR convenzionale per evidenziare la presenza di bande indicative dell’espressione dei geni ricercati, e tramite PCR multiplex semiquantitativa per esaminare le possibili differenze nei livelli di espressione dei geni. In parallelo, si eseguiranno esperimenti di “differential display-PCR” tramite i quali i cDNA di geni differenzialmente espressi vengono identificati a seguito di analisi di sequenze interne usando esameri “random” per la retro-trascrizione degli RNA e “primers” arbitrari per l’amplificazione. I prodotti di amplificazione saranno analizzati tramite elettroforesi su gel di poliacrilamide al 6% in un apparecchio per il sequenziamento, visualizzati per colorazione argentica, escissi dal gel e purificati tramite ulteriori cicli di amplificazione ed elettroforesi; in seguito, i frammenti di DNA purificati saranno sottoposti a sequenziamento e alla ricerca dell’omologia di sequenza del DNA nelle banche dati disponibili al fine di identificare il gene parentale del (o dei) prodotto(i) di amplificazione isolato(i). I risultati ottenuti dovranno essere confermati utilizzando tecniche più stringenti come il Northern blot o la PCR semi-quantitativa multiplex in presenza di “primers” specifici. Gli stessi esperimenti saranno condotti su preparazioni di RNA da cellule staminali mesenchimali adulte isolate a vari tempi di coltura a seguito di induzione del differenziamento in senso adipocitario e/o osteoblastico. Contemporaneamente saranno studiati i parametri di crescita e sopravvivenza cellulare tramite saggio con il cristal violetto, l'attività invasiva tramite saggi con camere di Boyden, il tasso di attività e di respirazione mitocondriale utilizzando molecole fluorescenti quali MitoTracker Green Orange e Red ed il JC-1 e si valuteranno inoltre i livelli di espressione di geni per subunità della citocromo ossidasi codificate dal genoma nucleare e da quello mitocondriale, nonchè i livelli ed i siti di accumulo dei corrispondenti prodotti proteici tramite Western blot con anticorpi specifici.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

Fingerprint

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