Effetto di componenti del microambiente sul fenotipo e sull'espressione genica di cellule di epitelio mammario umano tumorale ed immortalizzato

Nel presente progetto si valuterà l’influenza di componenti del micro-ambiente colturale quali collagene tipo V, cadmio e "parathyroid hormone-related protein" (PTHrP) sulla vitalità e capacità proliferativa di cellule di carcinoma mammario umano in coltura nonchè su cellule di epitelio mammario normale "immortalizzate", verificando l'espressione qualitativa e quantitativa di fattori pro- ed anti-apoptotici, caspasi, proteine da stress ed altri geni selettivamente attivati, nonché la presenza di altri marcatori legati alla proliferazione o alla morte cellulare

Sulla base di dati ottenuti e pubblicati negli anni precedenti, nel presente progetto si valuterà l’influenza di alcune componenti del mnicroambiente colturale, collagene tipo V, cadmio e "parathyroid hormone-related protein" (PTHrP) sulla vitalità e capacità proliferativa di cellule di carcinoma mammario umano in coltura e di epitelio mammario non tumorale ma "immortalizzate". In particolare lo studio sarà focalizzato sull'analisi dei livelli di espressione di fattori pro- ed anti-apoptotici, caspasi, proteine da stress ed altri geni selettivamente attivati, nonché sull'individuazione di altri marcatori legati alla proliferazione o alla morte cellulare. Le analisi sperimentali saranno condotte sulle linee cellulari neoplastiche MDA-MB231 e 8701-BC e sulla linea cellulare non tumorale da epitelio mammario umano HB2. La proferazione o la mortalità cellulare saranno saggiate tramite conta cellulare e colorazioni citochimiche (etidio bromuro, arancio di acridina, rosso neutro); lo stato del DNA genomico sarà valutato tramite "voltage gradient gel electrophoresis" ed altri eventi marcatori di morte cellulare da esaminare potranno essere la perdita del potenziale di membrana mitocondriale tramite la colorazione con il fluorocromo JC1, e l’esposizione di fosfatidilserina sul foglietto esterno del plasmalemma tramite incubazione con annessina marcata. Preparazioni di cDNA da cellule controllo e trattate saranno utilizzate per analisi dell'espressione di componenti del “pathway” apoptotico, di metallotioneine, di diverse proteine “heat shock” e fattori di risposta allo stress tramite PCR convenzionale e semi-quantitativa "multiplex" . Lo studio sull’espressione genica sarà inoltre esteso all’identificazione di altri geni differenzialmente espressi a seguito dei trattamenti. A tale scopo, si seguiranno i protocolli di “differential display-PCR” già messi a punto nel laboratorio del proponente, tramite i quali i cDNA di geni differenzialmente espressi vengono identificati a seguito di analisi di sequenze interne usando esameri “random” per la retro-trascrizione degli RNA e “primers” arbitrari per l’amplificazione. I prodotti di amplificazione saranno analizzati tramite elettroforesi su gel di poliacrilamide al 6% in un apparecchio per il sequenziamento e visualizzati per colorazione argentica. I prodotti di amplificazione differenzialmente espressi ottenuti mediante i metodi precedentemente descritti saranno escissi dal gel e purificati tramite ulteriori cicli di amplificazione ed elettroforesi; in seguito, i frammenti di DNA purificati saranno clonati e sequenziati. La ricerca dell’omologia di sequenza del DNA sarà effettuata utilizzando le banche dati disponibili “on-line” al fine di identificare il gene parentale del (o dei) prodotto(i) di amplificazione isolato(i). I risultati ottenuti tramite gli esperimenti di DD-PCR dovranno essere confermati utilizzando la tecnica di PCR semi-quantitativa “multiplex" in presenza di “primers” specifici e, in caso di conferma dell’espressione differenziale, ulteriori studi a livello di proteina potranno essere condotti.