Effetto del cadmio sulla vitalità e proliferazione di cellule di carcinoma mammario umano

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Il cadmio (Cd) è un minerale del sottosuolo estratto come contaminante dai giacimenti di Zn, utilizzato nell'industria dell'acciaio, della plastica e come componente delle batterie. Costituisce un inquinante industriale ed ambientale liberato in forma aerosolubile durante le fertilizzazioni e, in misura maggiore, come componente delle acque di scolo. E' noto che il cibo e l'acqua potabile sono la principale sorgente di assunzione giornaliera di Cd per l'uomo seguiti dall'inalazione di fumo di sigaretta. Il Cd è classificato nel gruppo I dei carcinogeni dall'Agenzia Intern. di Ric. sul Cancro (IARC,1993), e in numerosi studi gli si attribuisce un ruolo sia nella "iniziazione" tumorale, attivando oncogeni, che nella progressione, incrementando il potenziale metastatico delle cellule tumorali, attraverso meccanismi ancora da chiarire, ma che verosimilmente coinvolgono fattori molteplici. Nonostante il ruolo di induttore tumorale comunemente attribuitogli, esiste un numero sempre crescente di dati a supporto dell'onco-soppressione indotta dal Cd somministrato a dosi sub-tossiche a topi immuno-depleti inoculati con cellule tumorali. Infatti, è stato osservato che esso è in grado di ridurre marcatamente la crescita di cellule di sarcoma MSB, di plasmacitoma, di osteosarcoma di Dunn e di mioblasti tumorigenici L6, e di indurre necrosi tumore-specifica in un sistema modello di tumore epatico, preservando il tessuto normale circostante (Kerkvliet et al., 1979; Gray et al., 1982; Abshire et al., 1996; Waalkes et al., 1996). Più di recente, è stato provato che il Cd inibisce la crescita e la progressione di innesti eterologhi di tumore polmonare umano trapiantati in topi atimici (Waalkes and Diwan,1999). A livello cellulare e molecolare, diversi report recenti hanno fornito utili informazioni su alcuni aspetti della regolazione Cd-dipendente dell'espressione genica e dei "pathways" di trasduzione del segnale. Gli ioni Cd penetrano attraverso i canali del Ca++ presenti nel plasmalemma e si accumulano in sede intracellulare, in quanto capaci di legarsi a materiale citoplasmatico e nucleare. E' opinione comune che, almeno in alcune delle linee cellulari saggiate, basse concentrazioni di Cd siano in grado di indurre la sintesi del DNA, di innalzare l'espressione di parecchie classi di geni e di stimolare i "pathways" di segnalazione intracellulare e la proliferazione cellulare, laddove concentrazioni più elevate risultano essere inibitorie e citotossiche (Beyersmann and Hechtenberg,1997). D'altra parte, è ampiamente dimostrato che la sensibilità al Cd varia da un citotipo all'altro, e che le cellule tumorali sono le più responsive al trattamento con il metallo. Si può ipotizzare che il Cd possa indurre nelle cellule diverse risposte, che coinvolgono non soltanto i "pathways" di segnalazione di morte ma anche reazioni di difesa contro l'azione tossica (Ishido and Kunimoto,2001). Ad esempio, è stato dimostrato che il Cd a basse concentrazioni è in grado di stimolare la trascrizione di geni "immediate early" (c-fos, c-jun e c-myc), dell'oncosoppressore p53, e di geni che codificano per molecole "protettive", tra cui le metallotioneine, il glutatione, e le proteine "heat shock" (hsp). In particolare, l'aumento di espressione di alcune hsp, hsp70, hsp60 and hsp27, in risposta al Cd, è stato dimostrato in tessuti e cellule di organismi diversi, benchè il meccanismo tramite il quale le hsp esplicano la loro azione è poco noto. L'induzione di hsp potrebbe rendere le cellule resistenti alla tossicità di vari agenti e determinare un'inibizione dei processi ap

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Il programma di ricerca proposto prevede tre differenti sotto-progetti sperimentali e cioè: 1) la valutazione della sensibilità "in vitro" al Cd da parte di cellule epiteliali mammarie tumorali, 2) la valutazione dell'induzione di morte cellulare/apoptosi da aprte del metallo su cellule epiteliali mammarie tumorali, e 3) l'identificazione di geni differenzialmente espressi dalle cellule in presenza del Cd. Le analisi sperimentali saranno condotte su linee cellulari di tumore mammario ER-, come MDA-MB231, 8701-BC, Hs578T, dotate di differente potenziale maligno valutato in sistemi "in vivo", le quali sono verosimilmente insensibili all'azione estrogeno-mimetica del Cd a livello sia di espressione genica che di stimolazione della crescita cellulare, come riportato da Garcia-Morales et al. (J Biol Chem, 269,16896,1994) per le linee cellulari tumorali ER+. Sotto-progetto 1: In un primo set di esperimenti, dopo trattamento delle cellule con quantità crescenti di Cd (a partire da 1 uM) verrà valutata la concentrazione intracellulare dello ione per determinare il suo effettivo assorbimento. A tale scopo, in collaborazione con la Unità di Ricerca Filosa, i campioni saranno sottoposti a mineralizzazione e/o combustione e sui residui risultanti sarà determinato il contenuto di metallo mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico (AAS). La percentuale di sopravvivenza delle cellule in presenza di differenti concentrazioni di cadmio sarà esaminata dopo 24 h di incubazione tramite sia i) colorazioni citochimiche, che ii) saggi biochimici. Per gli esperimenti del punto i), cellule controllo e trattate saranno sottoposte a colorazione con una miscela di etidio bromuro ed arancio di acridina; il primo, essendo incapace a penetrare attraverso le membrane intatte delle cellule vitali, fungerà da marcatore morfologico per la valutazione della morte cellulare, mentre l'arancio di acridina servirà da contro-colorazione per la visualizzazione del numero di cellule totali presenti nel campo microscopico. La percentuale di cellule danneggiate sarà pertanto valutata a seguito dell'osservazione di un numero significativo di campi (Pucci-Minafra et al., Breast Cancer Res, 2000; Luparello et al., J Bone Miner Res, 16,2173,2001). Per i saggi al punto ii), si studierà l'incorporazione di rosso neutro e/o di timidina tritiata da parte delle cellule. In ambedue i casi, la capacità di concentrare il rosso neutro in sede lisosomiale, o di incorporare la timidina marcata nel DNA, verrà considerata un marcatore di vitalità cellulare e la percentuale di sopravvivenza valutata a seguito di lettura spettrofotometrica del rosso neutro o della determinazione della radioattività nei lisati cellulari (Luparello et al., J Bone Miner Res, 16,2173,2001). La modulazione del comportamento proliferativo delle cellule in risposta a cadmio a differenti concentrazioni sarà esaminata tramite sia i) determinazione del numero cellulare, che ii) esperimenti di bio-riduzione dell'MTS-tetrazolio. Per i saggi al punto i), le cellule saranno piastrate, trattate con cadmio a differenti concentrazioni e contate, dopo tripsinizzazione, in un emocitometro a tempi differenti, in maniera da poter calcolare e comparare il tasso di crescita (alfa) ed il tempo di raddoppiamento delle cellule controllo e trattate (vedi ad es. Luparello et al., Eur J Cancer 26,231,1990; Mol Cell Endocrinol 111,225,1995; Eur J Cancer 32A,702,1996; Carcinogenesis 18,23,1997; Breast Cancer Res Treat 54,235,1999). Per gli esperimenti del punto ii), cellule controllo e trattate con il cadmio saranno incubate in presenza
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva11/30/04 → …