EFFETTO DEI NEURONI E DELLE CELLULE GLIALI SULLA GENESI E SUL MANTENIMENTO DELLA BARRIERA EMATOENCEFALICA (BBB): POSSIBILE COINVOLGIMENTO DI VESCICOLE EXTRACELLULARI

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Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che le cellule dei capillari cerebrali (BCEC), coltivate su collagene IV, accumulano mRNA per occludina. Tuttavia, questo mRNA non viene tradotto a livelli significativi, a meno che le BCEC non siano coltivate con neuroni corticali (Savettieri et al., 2000). Inoltre, in presenza di neuroni, l’occludina si localizza correttamente alla periferia cellulare, suggerendo la formazione di una barriera ematoencefalica (BBB) funzionale. A conferma di ciò, molecole come la dopamina, incapaci di attraversare in vivo la barriera fisiologica, non attraversano neanche la membrana porosa sulla quale sono coltivate le BCEC (Cestelli et al., 2001). La localizzazione periferica dell’occludina viene anticipata di qualche giorno se le BCEC vengono coltivate in un sistema a tre tipi cellulari che contiene anche gli astrociti. Le osservazioni descritte suggeriscono che i neuroni e gli astrociti esercitano un controllo sulla traduzione dell’mRNA che codifica l’occludina. Dato che nel nostro sistema di coltura non esistono contatti fisici tra neuroni e cellule endoteliali, è probabile che il reclutamento dell’mRNA per l’occludina sui ribosomi e la sua conseguente traduzione siano indotti da fattori extracellulari rilasciati da neuroni e/o astrociti. Dato che una mole crescente di osservazioni suggerisce che il controllo della stabilità e della traducibilità degli mRNA è affidato in gran parte ad interazioni RNA-proteina (per un sommario, si veda Derrigo et al., 2000), è possibile che il bersaglio del segnale prodotto da neuroni/astrociti sia un qualche complesso proteina-mRNA occludina, entro il quale l’mRNA sia mantenuto in una forma inattiva, mascherata, non accessibile ai ribosomi.Partendo da queste considerazioni, nel corso della ricerca proposta, tenteremo di:1. Identificare i fattori prodotti e secreti, in forma solubile o inseriti in vescicole, da neuroni ed astrociti, e capaci di indurre la traduzione dell’mRNA occludina.2. Identificare i fattori cellulari capaci di legare specificamente l’mRNA per l’occludina e di sequestrarlo, bloccandone la traduzione. 3. Iniziare la purificazione dei fattori identificati ai punti 1 e 2.4. Studiare l’effetto di cellule nervose e gliali tumorali sulla tenuta della barriera ottenuta in coltura.

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Fasi della RicercaFASE 1A- Tenteremo prima di tutto di chiarire se i terreni nei quali sono stati coltivati i neuroni e/o gli astrociti (terreni condizionati) siano in grado di indurre nelle BCEC gli stessi effetti indotti dalla presenza fisica dei due tipi cellulari. A questo scopo:- I neuroni (prelevati da cervelli di feto di ratto al 16 giorno di gestazione) saranno coltivati, su laminina (Savettieri et al., 1999), in un terreno sintetico, privo di siero (Maat Medium, MM: Cestelli et al., 1985). - Gli astrociti (prelevati da corteccia cerebrale di ratti di due giorni d’età) saranno coltivati, invece, su fibronectina, in presenza di siero fino a quando non raggiungano la semiconfluenza (Schiera et al., 2003). Da quel momento saranno progressivamente adattati all’MM.- Colture a due ed a tre tipi cellulari saranno preparate utilizzando il sistema “transwell” (Savettieri et al., 2000; Schiera et al., 2003), costituito da piastre a 6 pozzetti e da inserti estraibili dotati di una membrana porosa, con pori da 0.4 micron (le dimensioni dei pori sono permissive al passaggio di vescicole). I neuroni verranno coltivati al fondo dei pozzetti; gli astrociti sulla faccia esterna degli inserti e le BCEC all’interno degli inserti.- Le BCEC (cellule endoteliali dei capillari cerebrali, immortalizzate: RBE4.B, donateci dalla Dott.ssa F. Roux, con il consenso della Neurotech SA, Orsay, Francia) verranno coltivate, su collagene IV, in una miscela DME/F12 (2:1) fino a semiconfluenza (Savettieri et al., 2000; Schiera et al., 2003). Come nel caso degli astrociti, da quel momento verranno adattate all’MM.- Le colture di neuroni, di astrociti, di neuroni e BCEC, di astrociti e BCEC, di neuroni, astrociti e BCEC saranno mantenute per 7-10 giorni, nel corso dei quali il terreno di coltura verrà cambiato ogni giorno. Il terreno rimosso verrà centrifugato a bassa velocià, per allontanare gli eventuali detriti cellulari, filtrato e congelato (terreno condizionato). - E’ importante sottolineare, a questo punto, che esperimenti preliminari, già condotti nel nostro laboratorio, indicano che i terreni “condizionati” sono effettivamente in grado di indurre nelle BCEC alcuni almeno degli effetti notati in presenza delle cellule nervose. Pertanto, i terreni “condizionati”, preparati come descritto sopra, verranno prima di tutto adoperati per confermare i dati già ottenuti; contemporaneamente, si procederà alla preparazione delle vescicole presenti nel terreno, utilizzando il protocollo in uso nel laboratorio della Prof. Vittorelli (Taverna et al., 2003).- Se l’effetto del terreno condizionato ed il ruolo delle vescicole verranno confermati, si procederà all’analisi delle componenti delle vescicole, nel tentativo di identificare le molecole attive, capaci di indurre gli effetti osservati sulle BCEC.FASE 1B- Tenteremo di identificare possibili proteine coinvolte nella regolazione della traduzione dell’mRNA per l’occludina. A questo scopo, avremo bisogno di uno specifico clone plasmidico, contenente la sequenza che codifica l’occludina di ratto, da usare come stampo per la trascrizione in vitro di sonde di RNA, da usare a loro volta in saggi di protezione da RNasi T1 (Scaturro et al., 1998; Nastasi et al., 1999). Un inserto di occludina di topo (omaggio del Dott. Furuse), è già disponibile nel nostro laboratorio. Se il meccanismo ipotetico che regola la traduzione dell’mRNA occludina si è conservato tra le varie specie di mammifero, le sequenze nucleotidiche cis-acting e le corrispondenti proteine leganti RNA, regolatrici, potrebbero essere anch’esse conservate. In tal
StatoFinito
Data di inizio/fine effettiva11/30/0411/29/06