Effetti interattivi sinergici indotti da agenti apoptotici sull’attivazione delle vie di Fas e TRAIL in modelli di tumori epatici in vitro e in vivo

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Sulla base di precedenti nostri studi che hanno evidenziato un potente effetto apoptotico sinergico tra inibitori del proteasoma e delle istone deacetilasi, tale progetto è volto a valutare, tanto su linee cellulari che su modelli in vivo di tumori epatici, il possibile sinergismo di tali classi composti con stimolatori del pathway apoptotico estrinseco mediato dal recettore TRAIL. A tale scopo saranno impiegati il bortezomib, il solo inibitore del proteasoma entrato nei trials clinici, attualmente impiegato per il trattamento del mieloma multiplo, ed il SAHA, inibitore delle deacetilasi istoniche, potente induttore di apoptosi in molti sistemi tumorali, recentemente entrato in fase clinica per alcuni linfomi follicolari.
Dati da noi acquisiti di recente indicano che bortezomib e SAHA, quando impiegati in associazione a basse dosi, sono in grado di indurre apoptosi in modo sinergico. Il meccanismo risulta correlato tanto al pathway apoptotico estrinseco mediato dal sistema Apo1/Fas, che al pathway intrinseco con marcate variazioni dei membri della famiglia Bcl-2 e attivazione delle caspasi.
E’ importante notare che gli inibitori delle istone deacetilasi sono in grado di sensibilizzare il recettore TRAIL all’evento apoptotico indotto da agonisti del recettore. Risulta, pertanto, interessante valutare se il meccanismo apoptotico sinergico tra bortezomib e SAHA in cellule di epatoma implica anche l’attivazione della via mediata da TRAIL. A tal fine, saranno dapprima valutati gli effetti della combinazione SAHA/bortezomib su componenti specifiche di tale via di segnalazione, come, ad esempio, l’effettore di morte TRADD o il fattore antiapoptotico FLIP. Saranno successivamente impiegati, ligandi ricombinanti di TRAIL in associazione tanto al SAHA impiegato singolarmente che alla combinazione SAHA/bortezomib, per valutare una eventuale sensibilizzazione dell’evento sinergico alla via di trasduzione indotta da tale recettore. In queste condizioni saranno, quindi, analizzate componenti di traduzione del segnale di morte ed in particolare l’effetto esplicato su caspasi -8 e Bid. L’effetto sinergico sarà valutato anche su componenti della famiglia Bcl-2 ed in particolare sui membri pro-apoptotici che derivano da splicing alternativo come le isoforme dei trascritti Bcl-X e Bim.
Inoltre, il progetto mira a trasferire i dati ottenuti in vitro su modelli in vivo di tumori epatici su topi nudi per avviare una fase di ricerca traslazionale. Si impiegheranno, a tale scopo, modelli “xenograft” che saranno prodotti inoculando cellule di epatoma in topi nudi. Sarà, quindi, valutata in vivo l’efficacia dei composti impiegati tanto da soli, a dosi efficaci, che in combinazione a dosi sub-ottimali. Tale fase del progetto sarà svolta in collaborazione con l’Istituto Regina Elena di Roma.

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Obiettivi

1. Valutare l’eventuale sensibilizzazione indotta dal SAHA o da trattamenti combinati SAHA/bortezomib sul pathway apoptotico estrinseco mediato dal recettore TRAIL.
A tale scopo, si intende considerare una possibile combinazione del SAHA, tanto impiegato da solo che con il bortezomib, con agonisti della via mediata da TRAIL. In particolare, sarà impiegato il ligando ricombinante umano solubile di TRAIL (TRAILr).
Tali valutazioni partono dal presupposto che il SAHA possa sensibilizzare elementi cellulari tumorali alla via di traduzione mediata da TRAIL. Verrà, quindi, analizzato, dapprima, l’effetto del SAHA, tanto da solo che in combinazione al bortezomib, sul pathway estrinseco mediato da TRAIL in cellule di epatoma umano in coltura. Le cellule saranno, quindi, trattate con diverse combinazioni dei composti in associazione a TRAILr per determinare eventuali effetti sinergici sulla vitalità cellulare e sull’apoptosi impiegando il modello matematico proposto da Chou e Talalay. Per evidenziare possibili effetti sinergici a livello molecolare saranno analizzati i mediatori di tale via apoptotica come ad esempio, la proteina TRADD, il fattore anti apoptotico c-Flip ed anche gli effettori comuni alla via mediata dal recettore FAS, come FADD, caspasi-8 e Bid.
2. Analizzare in vivo, su modelli “xenograft” in topi nudi, l’effetto del SAHA e del bortezomib, impiegati tanto singolarmente che in combinazione e l’eventuale associazione con il ricombinante TRAIL.
A tale scopo verranno impiegati topi nudi, preliminarmente sottoposti ad iniezione subcutanea di cellule di HepG2 o ad inoculo ortotopico delle stesse. I topi portatori di tumore (sia sub-cutanei che intra-epatici) saranno sottoposti a trattamento con concentrazioni di composti che non risultano tossiche per l'animale ed i risultati ottenuti verranno comparati a quelli ottenuti sugli animali controllo. I topi nudi che presentano il tumore verranno sottoposti al trattamento con la concentrazione ottimale del farmaco e sarà, quindi, valutata la percentuale di inibizione della massa tumorale. Dopo il sacrificio degli animali la massa tumorale prelevata sarà sottoposta a caratterizzazione anatomo-patologica, nonché ad analisi immuno-istochimiche e biochimiche per rilevare livelli di espressione di proteine coinvolte nella proliferazione cellulare e nell’apoptosi. In particolare, saranno valutati eventuali effetti sinergici in vivo relativi alla combinazione SAHA/bortezomib e la possibile sensibilizzazione all’effetto del ricombinante di TRAIL.


Metodologie

Saranno utilizzate cellule di epatoma umano HepG2, HuH-6, HuH-7 in coltura e come controllo cellule non tumorali epatiche Chang Liver o epatociti primari umani (PHH). Come agenti apoptotici saranno impiegati l’inibitore del proteasoma bortezomib e l’inibitore delle dacetilasi istoniche SAHA. I due composti saranno impiegati a concentrazioni sub-tossiche tali da esplicare un effetto sinergico quando somministrati in combinazione. La vitalità cellulare sarà valutata mediante i saggi colorimetrici che impiegano MTT o EZ4U, composti che vengono ridotti dalle deidrogenasi mitocondriali, producendo un cromogeno la cui concentrazione è direttamente proporzionale al numero di cellule vive. L’apoptosi sarà valutata mediante analisi morfologica al microscopio a fluorescenza dopo colorazione con acridina orange/etidio bromuro o Hoechst 33258. La distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo sarà determinata mediante citoflurimetria dopo colorazione con ioduro di propidio. I dati saranno analizzati mediante il software EXPO32. Il livello delle proteine e l’espressione di geni coinvolti nell’apoptosi saranno valutati rispettivamente mediante tecniche di western blot e RT-PCR. Esperimenti EMSA permetteranno di studiare il legame di fattori trascrizionali al DNA, e valutazioni di “supershift” della mobilità elettroforetica in presenza di specifici anticorpi consentira
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

Fingerprint

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