Effetti indotti dall'anandamide in cellule epatiche immortalizzate Chang Liver

Progetto: Research project

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Il progetto intende studiare gli effetti indotti dall’anandamide (AEA) nelle cellule non tumorali epatiche Chang liver. In particolare saranno sviluppati i seguenti punti: - Studio degli effetti citotossici dell’anandamide in cellule epatiche umane. Intendiamo confermare i nostri dati preliminari che indicano una particolare sensibilità all’AEA delle cellule non tumorali Chang liver rispetto a cellule epatiche tumorali. A tale scopo saranno condotti studi di tempo- e dose- dipendenza dell’effetto citotossico dell’AEA. - Studio dei meccanismi di interazione dell’anandamide con i componenti di membrana. E’ noto che l’azione dei cannabinoidi può essere mediata dai recettori di tipo CB1 e CB2 o dai recettori vanilloidi di tipo 1 (VR1). Recentemente è stato riportato che l’AEA può agire anche attraverso l’interazione diretta con i microdomini lipidici di membrana ricchi in colesterolo. Per studiare quale recettore o componente di membrana è implicato nell’azione indotta dall’AEA nelle cellule Chang liver, sarà valutato l’effetto del composto in presenza di specifici antagonisti per i recettori dei cannabinoidi (SR141716 per CB1 e SR144528 per CB2) e di metil beta-ciclodestrina, un depletore del colesterolo di membrana. - Studi sul coinvolgimento del ceramide e dello stress ossidativo. In diversi modelli cellulari l’attività pro-apoptotica dell’AEA si accompagna ad accumulo di ceramide e induzione di stress ossidativo. Per valutare se il ceramide media l’effetto indotto dall’AEA nelle cellule Chang liver, saranno condotti degli esperimenti utilizzando composti che attivano (Melittin) o inibiscono (desipramina) le sfingomielinasi, enzimi responsabili della idrolisi della sfingomielina. Valuteremo, inoltre, se la preincubazione con N-acetil-cisteina, un efficace antiossidante, è in grado di contrastare l’effetto citotossico della droga. In questa fase studieremo anche il coinvolgimento del mitocondrio mediante valutazione della caduta del potenziale di membrana mitocondriale e delle variazioni dei livelli dei fattori della famiglia Bcl-2. - Valutazione del sistema c-Jun/JNK. Poiché è noto che l’apoptosi indotta dall’AEA in molti casi si accompagna a variazioni delle attività delle MAP chinasi intendiamo accertare, mediante analisi di western blotting, eventuali variazioni dei livelli di JNK, p38 e MKK4 e delle relative forme fosforilate attive. Valuteremo, inoltre, lo stato di fosforilazione dei substrati delle MAP chinasi, i fattori c-Jun, JunB e JunD. Poiché questi fattori sono componenti del complesso trascrizionale AP-1, studieremo la capacità di binding al DNA di AP1, e con esperimenti di super-shift, evidenzieremo le proteine costituenti il complesso proteico AP1. Sarà interessante studiare se gli effetti indotti dall’AEA sui livelli e sullo stato di fosforilazione delle MAPK e dei relativi substrati si modificano in seguito al trattamento con l’antiossidante N-acetilcisteina.

Layman's description

L’obiettivo principale di questo studio è la valutazione del percorso attraverso cui l’anandamide induce apoptosi nelle cellule non tumorali Chang liver. In particolare intendiamo: - valutare attraverso quale componente di membrana l’anandamide agisce (tipo di recettore, CB1, CB2 o presenza di microdomini ricchi in colesterolo “lipid raft”); - studiare il meccanismo di azione del composto (coinvolgimento dello stress ossidativo, del mitocondrio); - studiare la cascata delle MAPK (JNK e p38). Intendiamo inoltre indagare sui meccanismi responsabili della resistenza mostrata dalle cellulari tumorali nei confronti del composto.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

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