Effetti di alcuni flavonoidi impiegati da soli o in combinazione in linee cellulari di leucemia mieloide cronica sensibile o resistente all'imatinib.

Uno dei motivi di fallimento delle attuali terapie antitumorali rimane l’emergenza di cloni cellulari resistenti ai farmaci. Questo purtroppo è stato dimostrato anche nei confronti dei nuovi farmaci “mirati” di recente introduzione per cui l’individuazione di sempre nuove molecole attive rimane uno degli scopi più urgenti della attuale ricerca oncologica. Nel caso della leucemia mieloide cronica (LMC) risultati rilevanti sono stati ottenuti recentemente con l’introduzione del nuovo inibitore della tirosinochinasi di bcr-abl, imatinib, farmaco capace di colpire selettivamente le cellule neoplastiche. Tuttavia, la recente segnalazione di casi di resistenza anche nei confronti di questa molecola ha stimolato nuove ricerche volte all’identificazione sia di nuovi farmaci attivi sia di composti in grado di ripristinare la sensibilità all’imatinib. In nostri precedenti studi risultati interessanti sono stati ottenuti con gli inibitori dell’HDAC che hanno mostrato di potenziare l’effetto dell’imatinib in cellule di leucemia K562 sensibili, con effetti meno significativi sulle cellule resistenti. I flavonoidi sono composti naturali dotati di diverse attività biologiche che potrebbero avere un ruolo come nuovi agenti anticancro. Scopo del presente studio sarà, quindi, quello di valutare se diversi flavonoidi come la galangina siano in grado di indurre effetti antitumorali significativi anche nella LMC sensibile o resistente all’imatinib e/o eventualmente di sensibilizzare le cellule all’effetto dello stesso imatinib. Inoltre sarà valutata l’attività della galangina in combinazione con altre molecole come i nuovi inibitori dell’HDAC MC1864 e MC1879 nelle linee sensibili e resistenti. Si procederà quindi a studiare i meccanismi alla base delle interazioni osservate e in particolare l’effetto dei trattamenti sui livelli di bcr-abl e l’eventuale coinvolgimento di molecole ad attività apoptotica o antiapoptotica o dei pathway che regolano il ciclo cellulare. I risultati ottenuti potranno essere utilizzati per ottimizzare ulteriormente le associazioni e definire dei protocolli da sperimentare in futuri studi in vivo.

Il presente studio si propone di valutare gli effetti in vitro della galangina e altri flavonoidi da soli o in combinazione con l’imatinib o con inibitori dell’HDAC su cellule di LMC sensibili o resistenti all’imatinib Gli obiettivi sono: 1) Valutare gli effetti citotossici e apoptotici della galangina in cellule di leucemia mieloide cronica sensibile e resistente all’imatinib. 2) Valutare gli effetti di una terapia di combinazione di galangina e imatinib nelle linee sensibili per identificare il tipo di interazione farmacologia tra le due molecole e nelle linee resistenti per valutare se la galalngina sia in grado di ripristinare la sensibilità al farmaco. 3) Studiare l’effetto di nuove combinazioni e in particolare dell’associazione di galangina e inibitori dell’HDAC sulle linee resistenti. 4) Identificare il tipo di interazione farmacologica tra le varie sostanze (additiva, sinergica positiva o negativa) mettendola in relazione con la modalità di trattamento (contemporanea o sequenziale). 5) Valutare i possibili meccanismi alla base delle interazioni riscontrate. In particolare si studierà la capacità delle sostanze, usate da sole o in combinazione, di modificare l’espressione di bcr-abl e il grado di attivazione di molecole apoptotiche (Fas, caspasi, bax ecc.) o antiapoptotiche (bcl2, IAP ecc.) o dei pathway che regolano il ciclo cellulare (cicline, RB, p21 ecc.). Cellule tumorali di LMC in coltura, e in particolare le linee sensibili K562 e KCL22 e le corrispondenti linee resistenti all’imatinib saranno esposte alla galangina da sola o in combinazione, utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi e sequenze di esposizione e valutando l’effetto citotossico, apoptotico e differenziante. La citotossicità sarà determinata utilizzando il test di esclusione al Trypan blue, mentre la capacità a indurre apoptosi sarà studiata mediante microscopia a fluorescenza e/o citofluorimetria a flusso. L’effetto differenziante sarà studiato in citofluorimetria utilizzando anticorpi anti CD61, anti CD11b e anti CD11c. L’interazione farmacologica sarà valutata calcolando l’indice di combinazione che risulta dal rapporto tra l’effetto ottenuto con la combinazione e quello dei singoli farmaci secondo il metodo del prodotto frazionale di Webb e/o isobologramma. Per valutare il tipo di pathway apoptotico attivato si valuterà l’attivazione delle caspasi mediante test colorimetrico e/o immunoblotting, la modificazione del potenziale di membrana mitocondriale (delta-psi) utilizzando il colorante fluorescente JC-1 in citofluorimetria e si studierà anche la capacità di inibitori specifici della via estrinseca e intrinseca dell’apoptosi come l’anticorpo anti-Fas ZB4, gli inibitori delle caspasi 8 (Z-IETD), 9 (Z-LEHD), 6 (Z-VEID) e 3 (Z-DEVD e Z-VAD) di influenzare l’effetto apoptotico dei farmaci. Per approfondire il meccanismo alla base delle interazioni riscontrate si valuterà, inoltre, la capacità delle combinazioni a modulare l’espressione di proteine regolatorie della proliferazione e della morte cellulare oltre che dell’oncogene specifico bcr-abl. In particolare, l’oncogene bcr-abl sarà studiato in Real Time PCR, l’espressione delle cicline, cdk, pRb, p21, STAT 5 e delle proteine della famiglia di bcl2 sarà misurata mediante citofluorimetria impiegando gli anticorpi fluoresceinati specifici, mentre l’espressione delle proteine inibitorie dell’apoptosi IAP sarà studiata in western blotting.