Effetti dell’inibizione della PARP in cellule di retinoblastoma umano caratterizzate dall’assenza della proteina Rb

Sintesi del programma di ricerca Il progetto intende valutare gli effetti determinati dalla somministrazione di 3-aminobenzamide (3-AB), un potente inibitore competitivo della PARP, a cellule di retinoblastoma umano in coltura. Gli studi saranno condotti su linee cellulari Y79. Inizialmente saranno analizzati gli effetti della 3-AB a concentrazioni variabili per tempi variabili attraverso lo studio della vitalità cellulare. Stabilite le dosi e i tempi ottimali da impiegare saranno valutati gli effetti sulla proliferazione, sul ciclo cellulare, sugli aspetti morfologici, sugli eventi apoptotici, sugli eventi differenziativi. Saranno valutate l'espressione della PARP e della PARG e i livelli di ADP-ribosilazione delle proteine nucleari (istoni, fattori di trascrizione, PARP stessa). E' noto che per assicurare la dinamica e reversibile ADP-ribosilazione delle proteine nucleari, la PARP (poli(ADP-riboso)-polimerasi) agisce in concerto con la PARG (poli(ADP-riboso)-glicoidrolasi). Questa analisi permetterà di stabilire una eventuale correlazione tra i livelli di PARP/PARG e lo stato di trasformazione cellulare. Se si evidenzierà una differenza negli istoni ADP-ribosilati, sarà valutato, tramite classici saggi di digestione nucleare, se questa condizione influenza lo stato strutturale e la dinamica della cromatina.

Obiettivi Sebbene l'esatto ruolo molecolare della PARP e dei polimeri di ADP-riboso debba essere ancora decifrato, diverse evidenze suggeriscono il loro coinvolgimento nel rimodellamento locale della cromatina, con il poli(ADP-riboso) che funge da impalcatura per il reclutamento di altri complessi proteici. Si può prospettare che l’inibizione della PARP in cellule tumorali con/senza Rb possa rappresentare un sistema attraverso il quale controllare la riprogrammazione della cromatina. Nostri studi suggeriscono che le cellule tumorali possano avere esagerati livelli di ADP-ribosilazione di proteine nucleari che potrebbe essere la causa della proliferazione aberrante espressa in tali linee tumorali. In tali cellule l’inibizione della PARP potrebbe indurre rimodellamenti della cromatina con riprogrammazione dell’espressione genica. Gli studi hanno anche suggerito l’esistenza di un cross-talk tra PARP e Rb. In rapporto a tale cross-talk PARP ed Rb coopererebbero allo svolgimento di un importante ruolo di controllo della dinamica della cromatina e dell’espressione genica: se Rb è presente, i rimodellamenti indotti dall’inibizione della PARP determinano down-regulation di prodotti genici richiesti per la proliferazione e upregulation dei quelli implicati nel differenziameno; se Rb è assente, il processo differenziativo fallisce e le cellule sono avviate al processo apoptotico. Questo progetto intende valutare gli effetti della 3-aminobenzamide, un potente inibitore competitivo della PARP, su cellule di retinoblastoma umano, un tumore maligno della retina, che si origina a causa dell’assenza della proteina Rb. Numerosi studi condotti nei nostri laboratori hanno dimostrato che l’assenza di questa proteina, insieme alla presenza di livelli particolarmente elevati di p53, rende tali cellule prone all’apoptosi che può, infatti, essere indotta da un numero elevato di composti di naura diversa. Il progetto si propone di verificare la validità dell’assunto recentemente formulato, in base al qule, vista l’assenza della proteina Rb nelle cellule di retinoblastoma, il trattamento con 3-AB dovrebbe indurre morte per apoptosi. Gli studi permetteranno di stabilire se anche nelle cellule di retinoblastoma la PARP può essere identificata come bersaglio di drogne anticancerose. Inoltre, essi potranno dare nuovi contributi alla comprensione dei meccanismi molecolari di controllo della dinamica della cromatina. Metodologie - Studio della vitalità, proliferazione e ciclo cellulare: le cellule saranno colorate con trypan blue e contate. La vitalità ed il numero cellulare saranno anche valutati attraverso il metodo MTT, dosaggio colorimetrico quantitativo basato sullo studio delle deidrogenasi mitocondriali. L’attività proliferativa e le fasi del ciclo cellulare saranno valutati in citofluorimetria: con etidio bromuro saranno quantificati il contenuto di DNA e la percentuale di cellule posizionate nelle fasi del ciclo cellulare; con bromodeossiuridina saranno evidenziate le cellule in fase S e con anticorpi anti PCNA quelle in fase G2-M. saranno anche usati anticorpi anti-cicline. - Morfologia delle cellule: per valutare modifiche morfologiche indotte dalle droghe, le cellule saranno osservate a fresco, con microscopio rovesciato; - Modifiche del citoscheletro: saranno impiegati anticorpi fluorescenti antiactina. - Aspetti differenziativi: saranno impiegati anticorpi fluorescenti antitubulina ed antineurofilamenti. - Aspetti apoptotici: dopo trattamento con coloranti intercalanti il DNA (DAPI, Hoechst 33258, etidio bromuro, arancio di acridina) le cellule saranno osservate con microscopio a fluorescenza; dopo estrazione del DNA genomico e elettroforesi su gel di agaroso sarà valutata la presenza di ladder; con citofluorimetria si valuterà la popolazione di cellule in fase preGo-G1; Estratti proteici saranno impiegati per valutare con western blotting: frammentazione della PARP, delle lamin