Effetti antitumorali di nuovi analoghi dell’adenosina impiegati da soli o in combinazione in linee cellulari di leucemia mieloide cronica sensibili o resistenti all’imatinib

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L’emergenza di farmaco resistenza rappresenta una delle principali cause di fallimento delle terapie antitumorali. Per tale motivo l’individuazione di nuovi farmaci attivi rimane uno degli scopi più urgenti della attuale ricerca oncologica. Nel caso della leucemia mieloide cronica risultati rilevanti sono stati ottenuti recentemente con l’introduzione del nuovo all’inibitore della tirosinochinasi di bcr-abl, imatinib, farmaco capace di colpire selettivamente le cellule neoplastiche. Tuttavia, la recente segnalazione di casi di resistenza anche nei confronti di questa molecola ha stimolato nuove ricerche volte all’identificazione sia di nuovi farmaci attivi sia di composti in grado di ripristinare la sensibilità all’imatinib. In nostri precedenti studi risultati interessanti sono stati ottenuti con il nuovo antimetabolita, analogo dell’adenosina e inibitore della ribonucleotide reduttasi, 3’-metiladenosina (3’-Me-Ado) che ha dimostrato di indurre una significativa attività citotossica e apoptotica in cellule tumorali di leucemia promielocitica acuta. Quindi, scopo del presente studio sarà quello di valutare se tale antimetabolita sia in grado di indurre effetti antitumorali significativi anche nella leucemia mieloide cronica sensibile o resistente all’imatinib e/o eventualmente di sensibilizzare le cellule all’effetto dello stesso imatinib. Inoltre sarà valutata l’attività della 3’-Me-Ado in combinazione con altre molecole come i nuovi inibitori dell’HDAC MC1864 e MC1879 nelle linee resistenti. Si procederà quindi a studiare i meccanismi alla base delle interazioni osservate e in particolare l’effetto dei trattamenti sui livelli di bcr-abl e l’eventuale coinvolgimento di molecole ad attività apoptotica o antiapoptotica o dei pathway che regolano il ciclo cellulare. I risultati ottenuti potranno essere utilizzati per ottimizzare ulteriormente le associazioni e definire dei protocolli da sperimentare in futuri studi in vivo.

Layman's description

Il presente studio si propone di valutare gli effetti in vitro della 3’-metiladenosina da sola o in combinazione con l’imatinib o con inibitori dell’HDAC su cellule di leucemia mieloide cronica sensibili o resistenti all’imatinib Gli obiettivi sono: 1) Valutare gli effetti citotossici e apoptotici della 3’-Me-Ado in cellule di leucemia mieloide cronica sensibile e resistente all’imatinib. 2) Valutare gli effetti di una terapia di combinazione di 3’-Me-Ado e imatinib nelle linee sensibili per identificare il tipo di interazione farmacologia tra le due molecole e nelle linee resistenti per valutare se la 3’-Me-Ado sia in grado di ripristinare la sensibilità al farmaco. 3) Studiare l’effetto di nuove combinazioni e in particolare dell’associazione di 3’-Me-Ado e inibitori dell’HDAC sulle linee resistenti. 4) Identificare il tipo di interazione farmacologica tra le varie sostanze (additiva, sinergica positiva o negativa) mettendola in relazione con la modalità di trattamento (contemporanea o sequenziale). 5) Valutare i possibili meccanismi alla base delle interazioni riscontrate. In particolare si studierà la capacità delle sostanze, usate da sole o in combinazione, di modificare l’espressione di bcr-abl e il grado di attivazione di molecole apoptotiche (Fas, caspasi, bax ecc.) o antiapoptotiche (bcl2, IAP ecc.) o dei pathway che regolano il ciclo cellulare (cicline, RB, p21 ecc.). Cellule tumorali di leucemia mieloide cronica in coltura, e in particolare le linee sensibili K562 e KCL22 e le corrispondenti linee resistenti all’imatinib saranno esposte alla 3’-Me-Ado da sola o in combinazione, utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi e sequenze di esposizione e valutando l’effetto citotossico e apoptotico. La citotossicità sarà determinata utilizzando il test di esclusione al Trypan blue, mentre la capacità a indurre apoptosi sarà studiata mediante microscopia a fluorescenza e/o citofluorimetria a flusso. L’interazione farmacologica sarà valutata calcolando l’indice di combinazione che risulta dal rapporto tra l’effetto ottenuto con la combinazione e quello dei singoli farmaci secondo il metodo del prodotto frazionale di Webb e/o isobologramma. Per valutare il tipo di pathway apoptotico attivato si valuterà l’attivazione delle caspasi mediante test colorimetrico e/o immunoblotting, la modificazione del potenziale di membrana mitocondriale (delta-psi) utilizzando il colorante fluorescente JC-1 in citofluorimetria e si studierà anche la capacità di inibitori specifici della via estrinseca e intrinseca dell’apoptosi come l’anticorpo anti-Fas ZB4, gli inibitori delle caspasi 8 (Z-IETD), 9 (Z-LEHD), 6 (Z-VEID) e 3 (Z-DEVD e Z-VAD) di influenzare l’effetto apoptotico dei farmaci. Per approfondire il meccanismo alla base delle interazioni riscontrate si valuterà, inoltre, la capacità delle combinazioni a modulare l’espressione di proteine regolatorie della proliferazione e della morte cellulare oltre che dell’oncogene specifico bcr-abl. In particolare, l’oncogene bcr-abl sarà studiato in Real Time PCR, l’espressione delle cicline, degli enzimi cdk, di RB, p21, STAT 5 e delle proteine della famiglia di bcl2 sarà misurata mediante citofluorimetria impiegando gli anticorpi fluoresceinati specifici, mentre l’espressione delle proteine inibitorie dell’apoptosi IAP sarà studiata in western blotting.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

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