Distribuzione e regolazione di un nuovo recettore purinergico a base guaninica

I nucleotidi (ATP, ADP) ed i nucleosidi a base adeninica sono stati da tempo coinvolti in diversi processi biologici come la neurotrasmissione, la contrazione muscolare, la funzione cardiaca, la vasodilatazione, la traduzione di segnali cellulari e l’attività di secrezione di differenti tipi cellulari. I loro effetti sono mediati da due distinte classi di recettori, recettori canali ligando-dipendenti (P2X) e recettori accoppiati alla proteina-G (P2Y). In contrasto ad un avanzamento della conoscenza sulle purine a base adeninica, scarsa attenzione è stata dedicata al potenziale ruolo delle purine extracellulari a base guaninica, cioè i nucleotidi GTP, GDP e GMP ed il nucleoside guanosina. Comunque, sono stati riportati degli effetti indotti soprattutto dalla guanosina, come la crescita, il differenziamento e la sopravvivenza cellulare, e un crescente numero di ricerche hanno suggerito che purine a base guaninica possono agire come neurotrasmettitore o neuromodulatore e come induttori di risposte trofiche. A fronte di tali informazioni funzionali, al presente non ci sono ancora dati di identificazione dei loro potenziali recettori transmembranari che trasducono segnali mediati da proteine-G. In questo contesto, è stato recentemente riportato un sito di binding per la guanosina e in studi in corso abbiamo contribuito alla identificazione e caratterizzazione del primo recettore responsabile di effetti biologici di nuscleosidi purinici a base guaninica (dati non pubblicati). Nel presente progetto di ricerca ci siamo proposti di estendere lo studio del nuovo recettore esaminando le caratteristiche di espressione tissutale, specialmente a livello del cervello, e la regolazione in modelli sperimentali di lesione cerebrale. A tale scopo saranno adoperate tecniche di ibridazione in situ, immunoistochimica, RT-PCR e western blotting per studiare l’espressione del recettore in condizione basale ed in modelli sperimentali di lesione cerebrale. La caratterizzazione dell’espressione basale e funzionale del nuovo recettore sarà di notevole aiuto allo studio e comprensione dei meccanismi di azione delle purine a base guaninica.

Obiettivi Recentemente abbiamo contribuito alla identificazione di un nuovo recettore per nucleosidi a base guaninica (guanosina) e nel presente progetto di ricerca intendiamo studiare: 1) il suo livello di espressione, sia durante lo sviluppo embrionale che postnatale, in diversi tessuti, con particolare attenzione al cervello; 2) la sua espressione in alcuni modelli di lesione cerebrale (trauma meccanico, epilessia indotta da kainato); Risultati attesi La caratterizzazione dell’espressione basale e funzionale del nuovo recettore sarà di notevole aiuto allo studio e comprensione dei meccanismi di azione delle purine a base guaninica. Metodologie L’analisi del pattern di espressione di RNAm del nuovo recettore sarà eseguita mediante RT-PCR ed ibridazione in situ seguendo le procedure da diversi anni in uso nel nostro laboratorio. L’analisi in RT-PCR sarà condotta su differenti tessuti, con particolare attenzione al cervello, durante lo sviluppo embrionale e postnatale. Questa analisi sarà determinante per conoscere quali tessuti ed organi esprimono il recettore e pertanto potenzialmente target dell’azione della guanosina. Se il nuovo recettore sarà trovato espresso nel cervello eseguiremo un’attenta analisi sulla localizzazione nelle diverse regioni cerebrali ed eventualmente sul tipo cellule. Pertanto nel cervello sarà condotta anche una identificazione delle cellule che esprimono trascritti per il recettore mediante l’uso della doppia marcatura, ottenuta combinando la ibridazione in situ con la immunoistochimica per markers cellulari specifici per neuroni o cellule gliali. Lo studio sull’espressione del nuovo recettore in modelli di lesione cerebrale sarà di rilevante interesse per conoscere la possibile regolazione del nuovo recettore su cellule neuronali e gliali nel corso di una risposta ad un danno cerebrale. Sarà studiata l’espressione del recettore a diversi intervalli di tempo dalla lesione ed eventualmente identificate le cellule coinvolte, usando la procedura della doppia marcatura, ibridazione in situ ed immmunoistochimica. La regolazione dell’espressione genica del recettore sarà valutata mediante analisi dell’espressione e misurazione dei livelli di RNAm, rispettivamente mediante ibridazione in situ e RT-PCR. La lesione meccanica o l’epilessia indotta da kainato sono modelli da diversi anni in uso nel nostro laboratorio.