Dinamica della cromatina nell'espressione genica

Alcuni lavori che abbiamo recentemente pubblicato (e altri esperimenti in corso di pubblicazione), suggeriscono fortemente che nei meccanismi di regolazione dell’espressione genica durante l’embriogenesi del riccio di mare Paracentrotus lividus, sono implicate proteine in grado di organizzare e modificare la cromatina. Ad esempio, abbiamo dimostrato il ruolo chiave svolto dall’isolatore cromatinico sns 5, del posizionamento dei nucleosomi e delle modifiche degli istoni, nella repressione del gene per l'istone precoce H2A allo stadio di gastrula. Per chiarire ulteriormente il meccanismo del silenziamento, intendiamo produrre anticorpi specifici contro proteine cromatiniche che potrebbero risultare utili all’individuazione di eventuali interattori. Prevediamo di articolare il progetto di ricerca nel seguente modo: 1. Identificare i complessi enzimatici modificatori dei nucleosomi. E’ molto probabile, che a livello di sequenze regolative come sns 5, siano reclutati dei complessi multiproteici, analoghi a complessi già caratterizzati in altri sistemi (es.drosofila), contenenti subunità con diverse attività enzimatiche e/o di riconoscimento per istoni variamente modificati. Poiché la maggior parte di queste proteine presenta domini catalitici o di eterodimerizzazione evolutivamente ben conservati, possono essere utilizzate le risorse derivanti dal sequenziamento del genoma del riccio di mare della specie Strongylocentrotus purpuratus per identificare in silico le sequenze codificanti per le istone acetilasi, deacitalisi e metilasi. Ciò dovrebbe consentire il disegno di oligonucleotidi degenerati per tentare di isolare tramite PCR, nella specie Paracentrotus lividus, le sequenze espresse corrispondenti. 2. Esprimere nei batteri porzioni delle regioni codificanti per proteine cromatiniche utilizzando opportuni vettori d’espressione, in grado di produrre proteine solubili nei batteri. Ciò dovrebbe consentire la produzione di anticorpi che potrebbero essere utilizzati per determinare, sia in vitro che in vivo, il legame delle proteine al DNA. 3. Mappare in vivo il legame delle proteine leganti l’ìsolatore sns 5. Per tale scopo verranno condotti esperimenti d’immunoprecipotazione della cromatina, rutinariamente utilizzata nel nostro laboratorio. Fino ad ora abbiamo identificato un fattore nucleare che in vitro è in grado di legare la sequenza dell’isolatore sns 5. E’ una proteina con omeodominio denominata BBF (BoxB Binding Factor). Riteniamo che BBF potrebbe essere uno dei fattori necessari al reclutamento degli enzimi di modificazione della cromatina. Per potere dimostrare tale ruolo dobbiamo necessariamente provare che BBF lega l’isolatore sns 5 in vivo. 4. Stabilire, mediante esperimenti di co-immunoprecipitazione o di GST pull-down, la presenza di fattori dell’isolatore cromatinico in un complesso proteico insieme a enzimi modificatori di nucleosomi.

Lo scopo di questo progetto di ricerca è quello di dimostrare la relazione tra architettura della cromatina e silenziamento del gene per l’istone H2A di riccio di mare. Per tale ragione è obiettivo primario identificare i componenti dell’apparato macromolecolare che si assembla a livello dell’isolatore cromatinico che abbiamo dimostrato essere coinvolto nel silenziamento del gene per l’istone precoce H2A di riccio di mare. Per raggiungere tale obiettivo ci proponiamo quindi: 1. Di produrre anticorpi contro la proteina BBF che presumiamo legare l’isolatore cromatinico sns 5. 2. Dimostrare mediante immunoprecipitazione della cromatina, il legame in vivo della proteina BBF all’isolatore sns5. 3. Dimostrare che il fattore BBF interagisce con la istone de-acetilasi e/o istone metilasi. 4. Dimostrare che il meccanismo di silenziamento comporta il reclutamento degli enzimi modificatori dei nucleosomi da parte dei fattori leganti l’isolatore cromatinico sns 5. La ricerca in banche dati dedicate interamente alle sequenze di riccio di mare (es. sul sito “sea urchin genomic resources” della NCBI), di ESTs contenenti i domini conservati, dotrebbe consentire l’identificazione dei geni di riccio di mare codificanti proteine coinvolte nella regolazione della struttura della cromatina. La maggior parte delle sequenze oggi disponibili sono della specie Strongilocentrotus purpuratus. L’elevatissimo grado di similitudine tra i genomi di specie diverse di riccio di mare dovrebbe semplificare la progettazione di primers per clonare, mediante RT-PCR, RACE o screening di library, dei geni omologhi di Paracentrotus lividus. La cromatina verrà preparata da embrioni di riccio di mare a vari stadi di sviluppo trattati con formaldeide per indurre legami crociati (cross-linking) tra DNA e proteine e proteine – proteine. Dopo sonicazione o trattamento enzimatico con la nucleasi micrococcale, la cromatina verrà digerita con enzimi di restrizione i cui siti sono localizzati nella regione promotore enhancer del immunoprecipitata con anticorpi specifici. Dopo reversione del crosslinking il DNA verrà purificato dalla cromatina immunoprecipitata e mediante PCR verrano amplificate le sequenze del promotore e dell'isolatore sns5. La costruzione di plasmidi e il clonaggio in vettori d’espressione verrà effettuata secondo protocolli standardizzati d’ingegneria genetica. Dopo sonicazione o trattamento enzimatico con la nucleasi micrococcale, la cromatina verrà digerita con enzimi di restrizione i cui siti sono localizzati nella regione promotore enhancer del immunoprecipitata con anticorpi specifici. Dopo reversione del cross-linking il DNA verrà purificato dalla cromatina immunoprecipitata e mediante PCR verrano amplificate le sequenze del promotore e dell'isolatore sns5. La costruzione di plasmidi e il clonaggio in vettori d’espressione verrà effettuata secondo protocolli standardizzati d’ingegneria genetica.