Dettagli progetto
Description
Alcuni lavori che abbiamo recentemente pubblicato (e altri esperimenti in corso di
pubblicazione), suggeriscono fortemente che nei meccanismi di regolazione dell’espressione
genica durante l’embriogenesi del riccio di mare Paracentrotus lividus, sono implicate proteine
in grado di organizzare e modificare la cromatina. Ad esempio, abbiamo dimostrato il ruolo
chiave svolto dall’isolatore cromatinico sns 5, del posizionamento dei nucleosomi e delle
modifiche degli istoni, nella repressione del gene per l'istone precoce H2A allo stadio di
gastrula. Per chiarire ulteriormente il meccanismo del silenziamento, intendiamo produrre
anticorpi specifici contro proteine cromatiniche che potrebbero risultare utili all’individuazione
di eventuali interattori. Prevediamo di articolare il progetto di ricerca nel seguente modo:
1. Identificare i complessi enzimatici modificatori dei nucleosomi. E’ molto probabile, che a
livello di sequenze regolative come sns 5, siano reclutati dei complessi multiproteici, analoghi a
complessi già caratterizzati in altri sistemi (es.drosofila), contenenti subunità con diverse
attività enzimatiche e/o di riconoscimento per istoni variamente modificati. Poiché la maggior
parte di queste proteine presenta domini catalitici o di eterodimerizzazione evolutivamente ben
conservati, possono essere utilizzate le risorse derivanti dal sequenziamento del genoma del
riccio di mare della specie Strongylocentrotus purpuratus per identificare in silico le sequenze
codificanti per le istone acetilasi, deacitalisi e metilasi. Ciò dovrebbe consentire il disegno di
oligonucleotidi degenerati per tentare di isolare tramite PCR, nella specie Paracentrotus lividus,
le sequenze espresse corrispondenti.
2. Esprimere nei batteri porzioni delle regioni codificanti per proteine cromatiniche utilizzando
opportuni vettori d’espressione, in grado di produrre proteine solubili nei batteri. Ciò dovrebbe
consentire la produzione di anticorpi che potrebbero essere utilizzati per determinare, sia in
vitro che in vivo, il legame delle proteine al DNA.
3. Mappare in vivo il legame delle proteine leganti l’ìsolatore sns 5. Per tale scopo verranno
condotti esperimenti d’immunoprecipotazione della cromatina, rutinariamente utilizzata nel
nostro laboratorio. Fino ad ora abbiamo identificato un fattore nucleare che in vitro è in grado
di legare la sequenza dell’isolatore sns 5. E’ una proteina con omeodominio denominata BBF
(BoxB Binding Factor). Riteniamo che BBF potrebbe essere uno dei fattori necessari al
reclutamento degli enzimi di modificazione della cromatina. Per potere dimostrare tale ruolo
dobbiamo necessariamente provare che BBF lega l’isolatore sns 5 in vivo.
4. Stabilire, mediante esperimenti di co-immunoprecipitazione o di GST pull-down, la presenza
di fattori dell’isolatore cromatinico in un complesso proteico insieme a enzimi modificatori di
nucleosomi.
Layman's description
Lo scopo di questo progetto di ricerca è quello di dimostrare la relazione tra architettura della
cromatina e silenziamento del gene per l’istone H2A di riccio di mare. Per tale ragione è
obiettivo primario identificare i componenti dell’apparato macromolecolare che si assembla a
livello dell’isolatore cromatinico che abbiamo dimostrato essere coinvolto nel silenziamento del
gene per l’istone precoce H2A di riccio di mare. Per raggiungere tale obiettivo ci proponiamo
quindi:
1. Di produrre anticorpi contro la proteina BBF che presumiamo legare l’isolatore cromatinico
sns 5.
2. Dimostrare mediante immunoprecipitazione della cromatina, il legame in vivo della proteina
BBF all’isolatore sns5.
3. Dimostrare che il fattore BBF interagisce con la istone de-acetilasi e/o istone metilasi.
4. Dimostrare che il meccanismo di silenziamento comporta il reclutamento degli enzimi
modificatori dei nucleosomi da parte dei fattori leganti l’isolatore cromatinico sns 5.
La ricerca in banche dati dedicate interamente alle sequenze di riccio di mare (es. sul sito “sea
urchin genomic resources” della NCBI), di ESTs contenenti i domini conservati, dotrebbe
consentire l’identificazione dei geni di riccio di mare codificanti proteine coinvolte nella
regolazione della struttura della cromatina. La maggior parte delle sequenze oggi disponibili
sono della specie Strongilocentrotus purpuratus. L’elevatissimo grado di similitudine tra i
genomi di specie diverse di riccio di mare dovrebbe semplificare la progettazione di primers
per clonare, mediante RT-PCR, RACE o screening di library, dei geni omologhi di Paracentrotus
lividus.
La cromatina verrà preparata da embrioni di riccio di mare a vari stadi di sviluppo trattati con
formaldeide per indurre legami crociati (cross-linking) tra DNA e proteine e proteine –
proteine. Dopo sonicazione o trattamento enzimatico con la nucleasi micrococcale, la
cromatina verrà digerita con enzimi di restrizione i cui siti sono localizzati nella regione
promotore enhancer del immunoprecipitata con anticorpi specifici. Dopo reversione del crosslinking
il DNA verrà purificato dalla cromatina immunoprecipitata e mediante PCR verrano
amplificate le sequenze del promotore e dell'isolatore sns5.
La costruzione di plasmidi e il clonaggio in vettori d’espressione verrà effettuata secondo
protocolli standardizzati d’ingegneria genetica.
Dopo sonicazione o trattamento enzimatico con la nucleasi micrococcale, la cromatina verrà
digerita con enzimi di restrizione i cui siti sono localizzati nella regione promotore enhancer del
immunoprecipitata con anticorpi specifici. Dopo reversione del cross-linking il DNA verrà
purificato dalla cromatina immunoprecipitata e mediante PCR verrano amplificate le sequenze
del promotore e dell'isolatore sns5.
La costruzione di plasmidi e il clonaggio in vettori d’espressione verrà effettuata secondo
protocolli standardizzati d’ingegneria genetica.
Stato | Attivo |
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Data di inizio/fine effettiva | 1/1/06 → … |
Fingerprint
Esplora i temi di ricerca toccati da questo progetto. Queste etichette sono generate sulla base dei riconoscimenti/sovvenzioni sottostanti. Insieme formano una fingerprint unica.