Differenziamento di cellule staminali mesenchimali umane e interazioni con il microambiente

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Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono una popolazione eterogenea di cellule precursori presenti in stadi di sviluppo successivi a quello embrionale, con la capacità di differenziare in diversi "lineage" cellulari di natura mesodermica e non. Le MSC derivate da tessuto adiposo adulto tramite liposuzione per le loro caratteristiche (disponibilità piuttosto elevata, buon potenziale autorigenerativo, differenziamento verso “lineage” cellulari multipli) oggi sono coinvolte in molte applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa. Per una ottimale utilizzazione delle MSC nella terapia cellulare e nei tessuti ingegnerizzati, appare fondamentale una sempre più dettagliata conoscenza del processo che regola il “commitment” iniziale, ancora poco noto, e dunque l'individuazione di nuovi marcatori molecolari specifici delle fasi iniziali del differenziamento verso i vari “lineage”, anche al fine di acquisire ulteriori strumenti per un migliore monitoraggio del processo differenziativo "in vitro”. Un altro aspetto di fondamentale importanza riguarda l'osservazione che sia le MSC che le cellule in via di differenziamento terminale possano giocare un ruolo prominente nella modulazione della tumorigenesi, agevolando o inibendo lo sviluppo e la crescita di masse neoplastiche nel tessuto colonizzato. Pertanto, risulta sempre più necessario caratterizzare l’effetto delle MSC sulla tumorigenesi in vitro ed in vivo per un controllo di sicurezza a lungo termine prima che le MSC possano essere utilizzate come strumenti terapeutici. Durante il primo anno, al fine di contribuire alle conoscenze biologiche del processo differenziativo delle MSC e trovare nuovi putativi marcatori di monitoraggio in vitro delle fasi precoci dell’osteo- ed adipogenesi, si studierà l’espressione dei prodotti di “splicing” del trascritto del PTHrP (parathyroid hormone-related peptide), noti per essere differenzialmente espressi in maniera tissu- e stadio-specifica, lo stato di metilazione dei promotori del gene e l’accumulo e la secrezione del prodotto proteico in MSC controllo e indotte. A tale scopo MSC isolate da lipoaspirati di tessuto adiposo umano saranno coltivate in condizioni controllo ed in presenza di osteo- o adipo-induttori per 4 settimane, estraendo per ogni settimana, il DNA e l’RNA totale e conservando il mezzo condizionato. L’RNA verrà sottoposto alla reazione di retrotrascrizione in presenza di random primers, e quindi amplificato tramite PCR con primers specifici sia per le isoforme di “splicing” al 5’, derivate dall’utilizzo di uno dei tre promotori del gene, che per quelle al 3’. I prodotti della PCR saranno analizzati tramite elettroforesi in gel d’agarosio al 2%. e sottoposti ad una analisi semi-quantitativa dell’espressione genica In base ai risultati ottenuti, allo scopo di verificare lo stato di metilazione dei promotori del gene del PTHrP, il DNA di cellule controllo ed indotte verrà sottoposto a “Methylation Sensitive Restriction Endonuclease (MSRE)–PCR”, che prevede un trattamento con gli enzimi HpaII e MspI diversamente sensibili allo stato di metilazione delle citosine ed una PCR in presenza di primers fiancheggianti regioni contenenti siti di taglio per le MSRE. La valutazione dell’accumulo intracellulare della proteina PTHrP nelle diverse condizioni sperimentali sarà effettuata tramite “Microtiter Immunocytochemical Enzyme-linked Immunosorbent Assay” che valuta in parallelo l’immunoreattività tramite reazione cromogenica con il substrato solubile TMB e la densità cellulare tramite colorazione con Blue Coomassie in preparazioni cellulari fissate e permeabilizzate. La secrezione extracellulare verrà quantificata tramite dot-blot di aliquote di mezzo condizionato e immunorivelazione indiretta con anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina ed NBT/BCIP come substrato. Durante il secondo anno, allo scopo di verificare
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/12 → …

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