Correlazione tra l’espressione dell’oncosoppressore NUMB e l’azione dei modulatori selettivi dei recettori per gli estrogeni (SERM) nel carcinoma mammario. Valutazione di eventuali effetti sinergici con gli inibitori del proteasoma.

Progetto: Research project

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Il rapporto tra l’oncosoppressore NUMB e l’oncogene NOTCH è fondamentale nel mantenere l’equilibrio tra proliferazione e differenziamento, poiché NUMB controlla le potenzialità oncogeniche di NOTCH. E’ noto che l’assenza o una ridotta espressione di NUMB, la cui degradazione è proteasoma-dipendente, si riscontra in circa il 50% dei tumori mammari. Tale evento porta alla riduzione dei livelli di p53, favorendo, in tali cellule, la progressione deregolata sostenuta tanto dalla caduta di p53 che dal sopravvento dell’azione di NOTCH, non più controllato negativamente da NUMB. Il presente progetto si propone di studiare in cellule di tumore mammario la variazione del rapporto NUMB/NOTCH in seguito al trattamento con i modulatori selettivi dei recettori per gli estrogeni (SERM) e gli inibitori del proteasoma (PI). E’ stato dimostrato che i SERM, che rappresentano ancora oggi farmaci di elezione nella terapia del carcinoma mammario, possono agire in maniera p53 dipendente e pertanto la loro azione può essere correlata con lo stato di NUMB. La nostra ipotesi di lavoro si basa sulla possibilità che l’utilizzazione dei PI possa, in qualche misura, favorire l’azione dei SERM, incrementando la disponibilità di NUMB, e quindi di p53, e potenziando, così, la loro attività antiproliferativa. Per la realizzazione del presente progetto intendiamo: -valutare i livelli di NUMB e NOTCH in cellule MCF-7 e MDA-MB-231, due linee cellulari utilizzate come modello sperimentale di carcinoma mammario umano, caratterizzate l’una dalla presenza (ER+) e l’altra dall’assenza (ER-) dei recettori per gli estrogeni. L’analisi verrà condotta tanto in condizioni basali che dopo trattamento delle cellule con SERM e PI. Saranno valutati inoltre eventuali effetti citotossici sinergici indotti dalle due classi di composti. Poiché i SERM, in particolare quelli di ultima generazione, sono in grado di agire anche in tumori ER- e/o con p53 mutata, intendiamo valutare il ruolo del rapporto NUMB/NOTCH nel percorso biochimico indotto in tali modelli tumorali dai SERM. Per meglio chiarire il ruolo di NUMB saranno valutati gli effetti della sua overespressione o del suo silenziamento mediante trasfezione genica. Interessanti osservazioni potrebbero giungere dall’analisi del pattern proteico complessivo valutato nello stato basale e dopo trattamento delle cellule con SERM e PI mediante analisi proteomica. Un ultimo aspetto di questa ricerca è rappresentato dall’analisi dei livelli di NUMB e del pathway biochimico da esso attivato in altri modelli sperimentali tumorali in cui l’azione di tale fattore non è stata analizzata o non è stata chiarita in modo completo. Noi auspichiamo che i risultati ottenuti possano contribuire a delucidare il ruolo di NUMB nella tumorigenesi, stabilire una correlazione tra l’azione dei SERM e lo stato del rapporto NUMB/NOTCH nel carcinoma mammario e gettare le basi per una nuova strategia terapeutica basata sulla sinergia di azione tra SERM e PI.

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Obiettivi Il presente progetto si propone di studiare il rapporto NUMB/NOTCH in cellule di tumore mammario e le sue variazioni in seguito al trattamento con SERM e inibitori del proteasoma. A tale fine intendiamo: - valutare i livelli di NUMB e NOTCH in cellule di carcinoma mammario MCF-7, caratterizzate dalla presenza di recettori per gli estrogeni (ER+) e dalla proteina p53 wild-type, e MDA-MB-231, prive dei recettori per gli estrogeni (ER-) e con proteina p53 mutata. I livelli saranno valutati tanto in condizioni basali che dopo trattamento con tamoxifene e ormeloxifene, un SERM di ultima generazione che sembra agire anche in cellule (ER-). - valutare i livelli di espressione dei due fattori dopo trattamento con inibitori del proteasoma usati singolarmente o in combinazione con i SERM. Noi ipotizziamo che la stabilizzazione di NUMB, indotta dagli inibitori del proteasoma, possa favorire l’evento di morte indotto dai SERM via p53. - valutare se le due classi di composti agiscono anche su cellule ER- e, in caso positivo, indagare sul meccanismo biochimico attivato. A tale scopo un’indicazione potrà essere fornita dall’analisi proteomica condotta in condizioni basali e dopo trattamento con le due classi di composti. - valutare mediante esperimenti di immunoprecipitazione se il trattamento con gli inibitori del proteasoma, da soli o in combinazione con i SERM, è in grado di incrementare l’interazione tra NUMB e p53 e quindi la sua stabilizzazione. - valutare la variazione degli effetti dei composti in seguito a silenziamento genico o a overespressione di NUMB. - valutare i livelli di NUMB in altri sistemi tumorali in coltura. Nel dipartimento di Scienze Biochimiche sono in uso numerose linee cellulari tumorali di origine differente (epatoma, carcinoma colorettale, osteosarcoma, retinoblastoma). Analizzare lo stato di NUMB in queste linee cellulari può contribuire alla conoscenza del ruolo di tale fattore nella tumorigenesi. Metodologie Il sistema sperimentale che intendiamo utilizzare per la realizzazione del presente progetto è costituito dalle cellule di carcinoma mammario MCF-7 e MDA-MB-231 in coltura. Le cellule saranno trattate con SERM (tamoxifene e ormeloxifene) ed inibitori del proteasoma (MG132 e bortezomib). Gli effetti citotossici saranno studiati sia mediante MTT che analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare, dopo colorazione con ioduro di propidio. La microscopia a fluorescenza, dopo colorazione delle cellule con opportune sonde (Hoechst, Arancio di acridina- bromuro di Etidio) e l’impiego del test dell’annexina V-FITC ci daranno informazioni sul tipo di morte indotta. Eventuali effetti sinergici tra composti diversi saranno valutati tramite l’applicazione di specifiche formule matematiche (Chou e Talalay). Mediante esperimenti di western blotting verranno valutati i livelli delle proteine p53, NUMB e NOCTH in condizioni basali e dopo trattamento con i composti utilizzati in singolo o in combinazione. In particolare, i livelli di p53 verranno valutati anche con anticorpi in grado di riconoscere specifici residui fosforilati per valutare lo stato di attivazione della proteina. Esperimenti di immunoprecipitazione saranno condotti per valutare l’interazione tra NUMB e p53 nelle cellule dopo trattamento con gli inibitori del proteasoma, da soli o in combinazione con i SERM. A tale scopo i lisati cellulari saranno sottoposti ad immunoprecipitazione con l’anticorpo per NUMB seguita da western blotting per p53. L’interazione sarà confermata invertendo l’uso degli anticorpi. Per dimostrare il ruolo del fattore NUMB intendiamo valutare gli effetti della riduzione dei livelli di espressione della proteina mediante silenziamento con un siRNA specifico che verrà trasfettato nelle cellule. L’efficienza di trasfezione verrà controllata sia mediante l’uso di siRNA coniugato alla fluoresceina (FITC) che analizzando i livelli della proteina stessa. Verran
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

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