Compartecipazione delle cellule staminali periferiche nella riparazione del danno da ischemia-riperfusione nel trapianto di rene da donatore cadavere.

Progetto: Research project

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Description

Il danno renale ischemia-riperfusione (I-R), nel campo del trapianto renale, gioca un ruolo chiave nella patogenesi della ritardata ripresa funzionale dell'organo trapiantato (DGF) (7). L'incidenza della DGF è del 20-30% nei trapianti renali da donatore cadavere e dipende dalla durata dell'ischemia fredda e dalle caratteristiche dell'organo. Questa condizione reversibile causa un significativo aumento della morbilità e mortalità precoce legata al trapianto.
Una migliore conoscenza dei processi di rigenerazione dopo un danno renale da I-R potrebbe contribuire allo sviluppo di strategie volte a ridurre l'incidenza della DGF e a trovare nuovi approcci farmacologici finalizzati a migliorare l'outcome del trapianto, sia a breve che a lungo termine.
Dal momento che, nei processi di riparazione dopo un danno renale ischemico, il ruolo delle cellule staminali residenti e non residenti è ancora oggetto di discussione, il nostro progetto sarà finalizzato a definire l'importanza delle cellule staminali di provenienza midollare nella compartecipazione sia nella rigenerazione delle cellule tubulari, che nel potenziale sviluppo delle lesioni croniche renali post-trapianto.
A tale scopo, prendendo in esame tutti i trapianti effettuati da donatore marginale dove l’incidenza di DGF è statisticamente maggiore proponendoci di :
1. Valutare la presenza delle cellule staminali renali residenti e mesenchimali (MSC) nel graft dopo il prelievo.
2. Studiare il numero e le caratteristiche delle MSC rilasciate in circolo dal midollo osseo del ricevente dopo l'I-R e durante la DGF.
3. Studiare il reclutamento delle MSC a livello del graft renale dopo l'I-R e durante la DGF.

Layman's description

Obiettivi:Una migliore conoscenza dei processi di rigenerazione dopo un danno renale da I-R potrebbe contribuire allo sviluppo di strategie volte a ridurre l'incidenza della DGF e a trovare nuovi approcci farmacologici finalizzati a migliorare l'outcome del trapianto, sia a breve che a lungo termine. Dal momento che, nei processi di riparazione dopo un danno renale ischemico, il ruolo delle cellule staminali residenti e non residenti è ancora oggetto di discussione, il nostro progetto sarà finalizzato a definire l'importanza di queste due popolazioni cellulari sia nella rigenerazione delle cellule tubulari, che nel potenziale sviluppo delle lesioni croniche dopo trapianto renale.
A tale scopo ci proponiamo di:
Fase1. Valutare la presenza delle cellule staminali renali residenti e di MSC nei reni del donatore prima del trapianto.
Fase 2. Studiare il numero e le caratteristiche delle MSC rilasciate in circolo dal midollo osseo dopo l'I-R e durante la DGF.
Fase 3. Studiare il reclutamento delle MSC a livello renale e valutare l'attivazione delle cellule staminali renali residenti nel modello animale di I-R e nella DGF.
Metodi:Verranno arruolati pazienti (pz) trapiantati in triplice terapia immunosoppressiva (MP-MMF-CYA) con DGF e con creatinina aumentata o invariata nei primi 3 giorni post-intervento e sottoposti a biopsia del graft tra il 7 e 10 giorno post-trapianto(Tx). Un campione della biopsia verrà usato per istologia di routine ed un altro verrà criopreservato in azoto liquido. I pz.con rigetto acuto saranno esclusi.
Fase1:
Le MSC renali, saranno identificate mediante immunofluorescenza indiretta ed analisi al microscopio confocale con Ab -anti MSC (CD31, c-kit) e per le cellule endoteliali vascolari (CD34, JG12). Una doppia marcatura evidenzierà l'espressione contemporanea del CD34 e del c-kit (o CD-117, fattore recettoriale delle cellule staminali), indice della presenza delle cellule staminali.L’espressione sia del CD-34 che del JG12 evidenzierà le cellule dell'endotelio vascolare. Valuteremo se le MSC renali esprimono i recettori per fattori chemiotattici che regolano l'homing delle MSC negli organi specifici quali quelli delle MSC derivate dal midollo osseo (CXCR4, CX3CR1, CXCR6, CCR1, CCR7). Per le cellule staminali renali residenti valuteremo la presenza Ag- Pax-2 e CD133 . Le cellule CD133+ e Pax 2+indicheranno la riparazione del danno renale. Le sezioni congelate verranno trattate prima con l'Ab- primario (gli Ab- anti-CD34 ed anti-CD31 diluiti 1: 50, gli anti-CD117 (c-kit) ed anti-JG12 diluiti 1:200) (l’Ab-anti-Pax-2 diluito 1:100 e l'anti-CD133/1 (AC133) alla concentrazione di 10mg/ml), per 2 h con lo specifico Ab- secondario (goat anti-rabbit IgG, diluito 1:200, goat anti-mouse IgG1, diluito 1:200). Le sezioni saranno analizzate mediante microscopio confocale a scansione laser.
Fase2
Valuteremo la presenza nel sangue delle cellule CD31+c-kit+ mediante citofluorimetria a 60’, 24, 48 e 72 h dal declampaggio durante il Tx di rene. Si analizzerà la correlazione tra il numero delle MSC circolanti e la durata della DGF e l'espressione a livello di membrana dei recettori chemochinici considerati nella fase 1. Le analisi citofluorimetriche mireranno a marcare le cellule con Ab-.anti-CD31 e anti-c-kit.
Fase3:
Studieremo sia il reclutamento delle MSC a livello renale sia la presenza di cellule Pax-2/CD133 positive nei grafts dopo danno da I-R con immunofluorescenza e microscopia confocale laser con Ab- specifici .Per meglio caratterizzare il ruolo dei recettori delle chemochine nel richiamo delle MSC e delle cellule staminali residenti a livello dell'area di tessuto danneggiato, le cellule staminali di ambedue i tipi saranno prelevate dai grafts in corso di DGF e coltivate in vitro per differenziarle in senso epiteliale e/o endoteliale. Infine, l'espressione di membrana dei recettori per le chemochine eventualmente coinvolte nella migrazione delle cellule in
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

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