CIONA INTESTINALIS,UN MODELLO PROTOCORDATO PER STUDIARE LA RISPOSTA INFIAMMATORIA(Endostilo, stadi larvali, giovanili).

Il progetto approfondisce lo studio del processo infiammatorio nel faringe branchiale di un’ascidia, Ciona intestinalis. L’importanza di questa specie come modello per analisi evoluzionistiche scaturisce sia dal sequenziamento del suo genoma e dai numerosi EST sia dalla recente proposta che le ascidie sono il sister group dei vertebrati. Le ricerche del nostro gruppo hanno riguardato l’immunità innata rivelando reclutamento di emociti, proliferazione, differenziamento, attività di epiteli, produzione di cDNA ed esame dell’espressione genica di fattori infiammatori (PRIN 2009) tra cui galectine, mannose-binding lectin (CiMBL), CiTNF-alfa. Questi fattori possono essere multifunzionali svolgendo attività agglutinanti, opsoniche, immunomodulatorie, riconoscimento, traffico cellulare, neutralizzante,citochinica, citotossica e possono essere coinvolte nello sviluppo. LPS inoculato nella parete corporea di Ciona attiva emociti nei vasi faringei che esprimono le molecole bioattive. Il presente progetto riguarda l’avanzamento delle conoscenze sull’espressione genica di Galectine, CiMBL, CiTNF di cui abbiamo isolato, sequenziato ed analizzato i cDNA. L’obiettivo generale riguarda il completamento delle conoscenze sul ruolo infiammatorio del faringe branchiale con riferimento all’endostilo, una struttura complessa con funzione tiroide-like e che esprime svariati geni. Inoltre si intende estendere l’analisi agli stadi larvali e metamorfosati con l’obiettivo di verificare ed approfondire l’espressione di geni dell’immunità innata nel corso della morfogenesi fornendo ulteriori elementi a supporto dell’ontogenic inflammation model. L’articolazione dello studio tra endostilo e forme larvali trova una facilitazione nell’applicazione parallela degli stessi metodi, l’utilizzazione delle stesse sonde e degli anticorpi che peraltro abbiamo già applicato negli studi sugli altri tessuti del faringe. Nel primo anno, verrà espiantato il faringe isolando l'endostilo, saranno preparati gli stadi larvali precoci, tardivi ed i giovanili metamorfosati a tempi diversi. Disponendo dei trascritti da animali inoculati con LPS, da animali inoculati con il medium e non trattati si effettuano analisi di real time PCR sull’endostilo e su stadi di sviluppo ed in base alla conoscenza di tratti di sequenza aa di ciascun fattore con proprietà antigenica verranno prodotti specifici anticorpi(Sigma). Utilizzando gli anticorpi prodotti da Sigma si effettueranno test di specificità con ELISA competitiva e Western blot utilizzando come inibitore il peptide specifico prodotto da Sigma come antigene. Tutti i campioni verranno trattati (metodi già pubblicati) per analisi di western blot e real time PCR per CiTNFalfa, Galectine, CiMBL. Si avvierà la preparazione di sonde (metodi pubblicati) per l'ibridazione in situ. L'analisi real time ci permetterà di valutare il coinvolgimento dell'endostilo nell'infiammazione, la precoce attività di geni dell'immunità innata nel corso dello sviluppo e della metamorfosi. Nel secondo anno, utilizzando le sonde previamente preparate, si procederà con l'ibridazione in situ nell'endostilo per identificare la/le zone di tessuto e le cellule eventualmente coinvolte nell'espressione genica di CiTNFalfa, Galectine e CiMBL. Si prepareranno estratti di endostilo, di stadi larvali e di giovanili da analizzare in western blot con gli anticorpi specifici e riverificati per specificità con inibizione competitiva del campione da analizzare. Si potrà così fare un riscontro di corrispondenza di taglia molecolare con i dati già pubblicati e verificare il probabile processo di oligomerizzazione che caratterizza molte lectine (galectine, MBL), mentre si verificherà la taglia di CiTNFalfa relativamente alla forma solubile e/o di membrana. I dati ottenuti consentono di contribuire alla comprensione del meccanismo di azione legato all'oligomerizzazione ed al