Catabolismo di idrocarburi e xenobiotici in batteri Gram-positivi ad alto contenuto in GC

Sintesi del Programma di Ricerca Gli attinomiceti, batteri Gram positivi del suolo ad alto contenuto in G+C, hanno una grande capacità di biotrasformazione e biodegradazione di composti contaminanti quali idrocarburi pesticidi ed altri xenobiotici. La conoscenza dei meccanismi molecolari responsabili dei processi di biotrasformazione e biodegradazione negli attinomiceti, e nei batteri Gram-positivi in generale, è limitata. Abbiamo recentemente isolato batteri gram positivi ad alto contenuto in GC degradatori di n-alcani a catena corta, media e lunga (da C8 a C36). I ceppi isolati sono stati identificati come appartenenti ai generi Rhodococcus, Gordonia e Nocardia tutti appartenenti agli actinomycetales ricchi in acidi micolici nella loro parete. Analisi PCR realizzate con primers degenerati hanno mostrato la presenza del gene alkB che codifica per una alcano-monossigenasi di membrana responsabile del primo step di idrossilazione dell'alcano ad alcol primario nel batterio Gram negativo Pseudomonas sp. I geni alk sono già noti per essere coinvolti nella degrdadazione di n-alcani fino a 16 atomi di carbonio mentre non sono noti geni o enzimi responsabili della degradazione degli alcani più lunghi. Il progetto si propone quindi di: 1. sequenziare l'intero cluster catabolico per gli n-alcani da uno dei ceppi batterici 2.Studiare l'espressione di tali geni in presenza di diversi range di n-alcani mediante analisi Real Time 3. mutare il gene alkB in uno dei ceppi isolati mediante tecnica Redirect utilizzata normalmente per gli streptomiceti 4.utilizzare i ceppi isolati in test di biodegradazione su suoli in microcosmi 5. effettuare nuovi isolamenti di batteri degradatori di idrocarburi e altre molecole contaminanti (es pesticidi etc.) da suoli e sedimenti marini. Sulla base dei risultati sarà possibile stabilire se i geni alk sono responsabili della degradazione degli n-alcani in batteri Gram positivi e in caso di risultati positivi si avrebbe la prima evidenza di un cluster genico coinvolto nella degradazione di n-alcani a catena lunga

Obiettivi e Metodi Verranno utilizzate metodologie di microbiologia classica, di biologia molecolare e di chimica analitica. 1.L'analisi dell'espressione dei geni alk verrà effettuata in Real Time assoluta durante varie fasi di crescita in presenza di n-alcani a diversa lunghezza. 2.Contemporaneamente verrà seguita la cinetica di degradazione dei substrati mediante analisi Gas Cromatografica in spettrometria di massa degli idrocarburi residui. 3. La mutagenesi dei geni alk verrà effettuata applicando e adattando la tecnica Redirect inizialmente messa a punto per gli Streptomiceti