CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE E FUNZIONALE DI GALECTINE NEL PROCESSO INFIAMMATORIO DI ASCIDIE. RELAZIONI EVOLUTIVE TRA MOLECOLE CYTOKINE-LIKE E LECTINE

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Attività da svolgere sono:1. Induzione della reazione infiammatoria nella parete corporea di C. intestinalis mediante iniezione di LPS. 2. Emociti in coltura a breve termine:rilascio di lectine, raccolta del medium e purificazione della frazione attiva con proprietà opsoniche verso lieviti; identificazione di lectine negli estratti di emociti prima e dopo lo stimolo con LPS e purificazione della frazione attiva opsonizzante 3. Purificazione da siero, tessuti e supernatanti di colture effettuata con diversi metodi cromatrografici: colonne idrofobiche,substrati legati a zuccheri diversi per i quali si è mostrata la specificità, RF-HPLC. Verifica del grado di purezza della frazione mediante passaggi cromatografici ed elettroforesi bidimensionale, analisi di specificità e legame con vari zuccheri per caratterizzare il CRD. Sequenziamento delle frazioni purificate affidato a ditte specializzate. 4. Analisi in silico delle sequenze ottenute con particolare riferimento ai geni di Ciona (collaborazione con l'UO di Milano). Identificazione e ricerca del/dei CRD. La messa punto di un efficiente sistema di purificazione consente di inviare campioni presso l'Istituto di Marine Biotechnology (Baltimore, USA)per studi cristallografici. 5. Saggio delle frazioni isolate, per specificità, attività agglutinante, opsonica (eritrociti, lieviti, batteri),e mitogenica (emociti di ascidia, tessuti emopoietici, linee di mammifero, linea cellulare murina B9). Quest'ultima attività è riconducibile a IL di mammifero. Per l'attività mitogenica della lectina ci si avvale del FACS del gruppo di Biologia dello sviluppo del CNR di Palermo. Saggi di inibizione delle attività con anticorpi eterologhi specifici per IL e altre citochine. Per controllare il contenuto di galectine e lectine di tipo-C- galattosio-specifiche, separazioni e saggi biologici saranno eseguiti in presenza/assenza di calcio. Immunoistochimica di tessuti ed immunoblotting di loro estratti con anticorpi eterologhi e/o possibilmenti prodotti verso la frazione purificata. Eventuale eluzione dall'immunoblotting. 6. Studio dell'espressione genica (galectine, IL1, TNF, IL6) durante la risposta infiammatoria. In collaborazione con l’UO di Milano:clonaggio ed sequenziamento di cDNA mediante l’uso di primers disegnati su sequenze note di galectine annotate nel genoma, e mediante primers degenerati disegnati su sequenze amminoacidiche delle lectine isolate. 5’ and 3’ RACE usando primers disegnati sulla sequenza parziale ottenuta. Sequenziamento dei cDNA affidato a ditte qualificate e si conseguente analisi di bioinformatica. 7. Eventuale produzione di specifici anticorpi(Sigma)contro peptidi sintetici disegnati su sequenze aminoacidiche dedotte di cDNA isolati, ed utilizzati in parallelo o alternativa, e usati per rilevare l'espressione di lectine. 8. Studio di cDNA/EST per identificare i geni espressi nei tessuti di ascidia in seguito a stimolazione, considerando i trascritti che presentano una significativa omologia con i geni dei vertebrati coinvolti nella risposta infiammatoria, come il TNF. 8. Analisi dell’espressione genica nei tessuti infiammati a vari intervalli di tempo condotta con SSH e Real Time PCR. 9. Completamento del ruolo della PO nell'infiammazione e relativa espressione genica partendo dalle sequenze di due isoforme di PO di Ciona 10. Per validare i risultati si potranno comparativamente esaminare natura ed espressione di lectine in altre ascidie solitarie

Layman's description

Il repertorio delle lectine nei protocordati. Evoluzione dei meccanismi di riconoscimento e dell'immunità innata
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …