Caratterizzazione funzionale dell'isolatore cromatinico sns5 di riccio di mare per il miglioramento delle tecniche di transgenesi.

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Gli esperimenti di trasferimento genico pongono sempre una serie di interrogativi riguardanti le modalità di espressione dei transgeni nelle cellule bersaglio (soprattutto in merito a: indipendenza dal punto di integrazione, efficienza e stabilità a lungo termine dell’espressione). In seguito alla microiniezione di transgeni nel citoplasma di molti sistemi sperimentali animali, è stata documentata un’incorporazione a mosaico nel genoma lungo il corso dell’embriogenesi. Infatti, durante la segmentazione, l’integrazione di frammenti di DNA si verifica in maniera casuale soltanto in pochi nuclei, generando un profilo di espressione clonale del transgene. In aggiunta, un grosso limite degli attuali approcci di terapia genica è dato dall’elevata suscettibilità dei vettori retrovirali a) all’“effetto posizione” impartito dalle sequenze cromosomali del sito di integrazione, e b) al silenziamento, in particolare nelle cellule staminali. La risoluzione di questi problemi è assolutamente necessaria per ricavare benefici clinici in alcune patologie come la talassemia, a causa dell’uso di cellule staminali per il trasferimento genico e il bisogno di avere alti livelli di espressione regolata del transgene. Gli isolatori cromatinici potrebbero essere strumenti estremamente utili per l’ideazione di vettori di espressione che risolvono queste complicazioni, dal momento che possono essere di piccole dimensioni e mancare di specificità per enhancers e tipi cellulari. L’elemento isolatore di riccio di mare sns5, da noi originariamente identificato, sembra soddisfare questi criteri. Ne consegue che uno studio più approfondito di sns5, mirato alla comprensione del suo meccanismo molecolare di funzionamento, può sia offrire l’opportunità di migliorare i protocolli di transgenesi che trovare applicazione nel settore della terapia genica. L’embrione di riccio di mare Paracentrotus lividus, dal cui genoma sns5 è stato originariamente identificato, rappresenta il sistema di elezione per questo tipo di studio. Attraverso un approccio combinato tra indagini in silico e il completamento di uno screening di tipo one-hybrid, prevediamo di identificare alcuni tra i fattori nucleari reclutati sulle sequenze di sns5. Il legame dei suddetti regolatori ad sns5 sarà dimostrato grazie ad un saggio di transattivazione in vivo e mappato ricorrendo alla tecnica di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Per quest’ultimo scopo sarà necessario avviare un protocollo di immunizzazione che porti alla produzione di anticorpi specifici. Inoltre, aliquote degli anticorpi purificati saranno microiniettate in zigoti in via di sviluppo, al fine di sequestrare specificamente i fattori corrispondenti e impedirne il legame ad sns5. Ciò dovrebbe compromettere la funzione dell’isolatore, esponendo il promotore di H1 all’influenza dell’enhancer di H2A. Quest’approccio ci permetterà di chiarire definitivamente se i fattori identificati concorrono a garantire la funzione di sns5 in vivo. L’analisi funzionale di transgeni isolati e non isolati ci permetterà di determinare l’abilità di sns5 di minimizzare la quota di effetti repressivi che si verificano durante il processo di transgenesi. Rispetto agli embrioni iniettati con le corrispondenti costruzioni non isolate, ci aspettiamo un miglioramento dell’efficienza di espressione transgenica in termini di: incremento della frazione di embrioni esprimenti, riduzione del grado di mosaicismo, ampliamento del dominio di espressione spaziale e conseguente aumento dell’abbondanza di trascritti transgenici (misurabile mediante qPCR). Inoltre, dal momento che sns5 può schermare i promotori dall’influenza degli elementi di regolazione circostanti, dovrebbe anche prevenire l’espressione ectopica dei transgeni. In aggiunta, ricorrendo alla tecnologia Chromosome Conformation Capture, vorremmo valutare se sns5 concorre all’instaurazione di u
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/12 → …

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