Caratterizzazione dei pathway in grado di modulare gli effetti negativi di Ras2 iperattivato e Sch9 overespresso

Progetto: Research project

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Saccharomyces cerevisiae ha svolto un ruolo importante come strumento per la conoscenza della biochimica e della biologia molecolare delle cellule di mammifero. La maggior parte di questo sforzo si è concentrato sulla caratterizzazione delle migliaia di geni coinvolti nella crescita cellulare, resistenza alla tossicità acuta e morte. La chronological lifespan (CLS) ha introdotto un paradigma dell'invecchiamento molto semplice, basato sulla misura dei danni cellulari e della sopravvivenza di cellule di lievito in fase postmitotica. In combinazione con potenti mezzi genetici e tecnologie high throuhput la CLS ha permesso l'dentificazione di geni e pathway correlati con l'invecchiamento, ma ha anche introdotto un paradigma molto semplice per studiare le modificazioni cellulari e molecolari che avvengono durante l'invecchiamento e le patologie correlate. La conservazione degli stessi pathway anche negli eucarioti superiori, verificata piu' volte, giustifica l'uso del lievito come modello per l'invecchiamento e le patologie ad esso correlate. Durante questo progetto ci proponiamo di combinare l'effetto pro-invecchiamento dell'overespressione di Sch9 e della iperattivazione di Ras2 con la CLS e con la resistenza agli stress ossidativi per identificare nuovi pathway coinvolti nell'invecchiamento e nel cancro. Durante questo progetto sarà generata una collezione di lieviti con delezioni genomiche su qualunque gene non essenziale mediante una tecnica di mutagenesi basata sull'inserzione random di un trasposone sul genoma di lievito. Verificheremo quali tra queste delezioni sono in grado di sopprimere la riduzione della vitalità e della resistenza agli shock termici e ossidativi conseguente alla iperfunzione di Ras2 e/o Sch9.Appena avremo identificato dei pathway interessanti la nostra analisi si estenderà agli altri componenti dello stesso pathway. Tipicamente la distruzione del gene, la sua overespressione e la localizzazione della proteina corrispondente faranno parte della nostra analisi. Infine doppi e tripli mutanti verranno realizzati e analizzati con geni noti interagire con il pathway di Ras e con altri geni identificati grazie a questo screening. La longevità come anche la stress resistenza faranno parte dei fenotipi che andremo ad analizzare. I risultati di questo progetto potranno permettere di identificare nuovi geni e pathway in grado di modulare l'azione di questi due noti ‘pro-aging' pathway. Inoltre abbiamo recentemente messo a punto una strategia sperimentale in grado di mettere in evidenza le variazioni della resistenza agli stress in funzione della somministrazione di nutrienti. Intendiamo adoperare questa nuova strategia, che ci ha gia' permesso di identificare i pathway di risposta cellulare ai diversi nutrienti (Mirisola, Taormina and Longo, 2012 submitted), per identificare in che modo i pathway in grado di modulare la funzione dei principali pro-aging pathway sono in grado di essere modulati in risposta ai nutrienti. In questo modo riteniamo di potere sviluppare un approccio integrato tra manipolazioni geniche e somministrazione di nutrienti che permettera' un quadro piu' chiaro nella comprensione della complessa interazione tra la componente genetica e quella ambientale nella risposta agli stress e nella longevita'. Risultati preliminari: Poiché la delezione sia di Ras2 che di Sch9 provoca un aumento della logevità abbiamo verificato se l'overespressione e/o overattivazione di queste proteine potesse di converso provocare una riduzione della vitalità. Per fare questo abbiamo adoperato sia la versione wild type che la versione ‘oncogenica' (Ras2G19V) della proteina Ras2 clonati sia su un vettore centromerico (pRS416) che su un vettore ad alto numero di copie (YEp51). Come atteso la proteina Ras2G19V, la cui iperattività è dovuta alla sua incapacità di idrolizzare il GTP ad essa legato, riduce drasticamente, anche quando espressa da un vettore a bass
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/12 → …

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