Cambiamenti cromatinici localizzati indotti dai modulatori della PARP

Sintesi del programma di ricerca Il progetto intende valutare gli effetti determinati dalla somministrazione di attivatori/inibitori della PARP in cellule tumorali. Nelle linee cellulari nelle quali si manifesteranno gli effetti più significativi, gli studi proseguiranno attraverso la valutazione delle modifiche strutturali indotte nella cromatina. Gli studi saranno condotti: A) -- su varie linee di cellule tumorali umane coltivate routinariamente nei nostri laboratori: - cellule di osteosarcoma Saos-2 e MG-63 - cellule di retinoblastoma Y79 -cellule di tumori epatici HepG2, HuH-6; -cellule di carcinoma colon-rettale HT29 e SW620. B)-- su Drosophila melanogaster, allevata nei nostri laboratori. Il recente reclutamento nel nostro dipartimento del Dott. Davide Corona, un ricercatore sponsorizzato da Telethon, con competenze biochimiche di dinamica della cromatina in Drosophila, faciliterà i nostri studi sulla PARP. La Drosophila è un organismo modello d'elezione non solo per gli studi di genetica classica, ma anche per i potenti strumenti e reagenti biochimici che sono stati sviluppati nell'ultimo decennio per lo studio della struttura e dinamica della cromatina. La Drosophila ha un unico gene PARP che codifica per una proteina con alte omologie strutturali e funzionali con quella umana. Come saggio molecolare per i nostri studi verranno monitorati i cambiamenti della struttura ed organizzazione dei cromosomi politenici contenuti nelle ghiandole salivari di Drosophila, in seguito a trattamento con inibitori/ attivatori della PARP. Inizialmente intendiamo analizzare l'espressione della PARP e della PARG. E' noto che per assicurare la dinamica e reversibile ADP-ribosilazione delle proteine nucleari, la PARP (poli(ADP-riboso)-polimerasi) agisce in concerto con la PARG (poli(ADP-riboso)-glicoidrolasi). Questa analisi permetterà di stabilire una eventuale correlazione tra i livelli di PARP/PARG e lo stato di trasformazione cellulare. L'effetto dell'azione coordinata di PARP/PARG sarà studiato attraverso l'analisi di proteine nucleari poli-ADP-ribosilate (istoni, fattori di trascrizione, PARP stessa). Il ruolo della transiente ADP-ribosilazione sarà anche studiato dopo deplezione/attivazione della PARP impiegando gli inibitori/attivatori della PARP che avranno manifestato i più potenti effetti. Pertanto, in parallelo, dopo trattamento con inibitori/attivatori della PARP, le varie linee cellulari saranno monitorate per vitalità, proliferazione e ciclo cellulare, per modifiche morfologiche, per eventi apoptotici. Se si evidenzierà una differenza negli istoni ADP-ribosilati, sarà valutato, tramite classici saggi di digestione nucleare, se questa condizione influenza lo stato strutturale e la dinamica della cromatina. Tale analisi sarà complementata da tecniche citologiche di immunofluorescenza in Drosophila analizzando la struttura cromosomica nel gene PARP di mutanti di Drosophila o di Drosophila wild-type dopo trattamento con gli inibitori/attivatori della PARP.

Obiettivi Processi cellulari come la trascrizione e l'organizzazione dei cromosomi richiedono l'accesso a sequenze specifiche di DNA. Per questo, le cellule eucariotiche hanno sviluppato "macchine molecolari" in grado di rimodellare la struttura della cromatina. Una via di regolazione della struttura cromatinica è rappresentata da modifiche covalenti delle code degli istoni operata dalla PARP per aggiunta di polimeri di ADP-riboso. Sebbene l'esatto ruolo molecolare della PARP e dei polimeri di ADP-riboso debba essere ancora decifrato, diverse evidenze suggeriscono il loro coinvolgimento nel rimodellamento locale della cromatina, con il poli(ADP-riboso) che funge da impalcatura per il reclutamento di altri complessi proteici che sarebbero in grado di cambiarne lo stato di attivazione. Poiché risultati da noi ottenuti suggeriscono uno scenario nel quale una alterata ADP-ribosilazione di proteine nucleari potrebbe essere la causa della proliferazione aberrante espressa in alcune linee di cellule di tumori umani, riteniamo che la manipolazione della PARP potrebbe permettere il controllo sperimentale della riprogrammazione della cromatina. L’obiettivo di questo progetto è quello di valutare se l’impiego di inibitori/attivatori della PARP, in diverse linee di tumori umani in coltura, possa indurre una modulazione nella struttura cromatinica che potrebbe determinare una riprogrammazione dell'espressione genica. Negli ultimi anni sta diventando sempre più evidente che uno dei targets interessanti per la prevenzione e la terapia del cancro possa essere la reversione dell'aberrante silenziamento genico mediato da eventi epigenetici associati con la repressione della trascrizione. Epigenetica e genetica sono complementari nel campo dell'eziologia del cancro ed è possibile che le alterazioni epigenetiche contribuiscano alla progressione tumorale e, anche, incrementino la probabilità che cambiamenti genetici possano condurre allo sviluppo del cancro. In contrasto con le cause genetiche del cancro, la possibilità di revertire i codici epigenetici può fornire nuovi targets per interventi terapeutici. Per questo motivo, l'analisi dei meccanismi molecolari che determinano cambiamenti strutturali della cromatina, indotti da modulatori della PARP, è un argomento di ricerca molto innovativo ed originale che nel prossimo futuro potrebbe condurre a nuove strategie terapeutiche contro il cancro. In conclusione, complessivamente, questi studi sono obiettivati a valutare gli effetti esercitati da vari stati funzionali delle PARP sulla dinamica della cromatina e a determinare il potenziale ruolo anticanceroso di modulatori della PARP. Metodologie -- misure dei livelli di PARP e PARG: lo studio sarà condotto con western blotting e con microscopia a fluorescenza impiegando specifici anticorpi; i livelli dei rispettivi mRNA saramnno misurati con RT-PCR usando specifici primers e protocolli di amplificazione. -- analisi delle proteine ADP-ribosilate: saranno sviluppati western blotting di estratti di proteine nucleari impiegando anticorpi anti-poli(ADP-riboso) che riconoscono catene di ADP-ribosio. Proteine ADP-ribosilate saranno misurate dopo immunoprecipitazione con specifici anticorpi e analisi per western con anticorpi anti poli(ADP-riboso). -- trattamenti: le cellule saranno trattate sia con inibitori (3-AB, ISQ, NU1025, AG14361) che con attivatori (agenti alkilanti il DNA, N-metil-nitro-N-nitrosoguanidina, perossido di idrogeno) della PARP. -- studio della vitalità, proliferazione e ciclo cellulare: le cellule saranno colorate con trypan blue e contate. La vitalità ed il numero cellulare saranno anche valutati attraverso il metodo MTT, dosaggio colorimetrico quantitativo basato sullo studio delle deidrogenasi mitocondriali. L’attività proliferativa e le fasi del ciclo cellulare saranno valutati in citofluorimetria: con etidio bromuro saranno quantificati il contenuto di DNA e la perce