Azione sinergica degli inibitori del proteasoma e delle deacetilasi istoniche nell'induzione di apoptosi in cellule di epatoblastoma umano: accertamento del meccanismo molecolare d'azione.

    Progetto: Research project

    Dettagli progetto

    Description

    1)E’ noto che i membri della famiglia Bcl-2 esplicano un ruolo fondamentale nel controllo dell’apoptosi, poiché alcuni membri promuovono la sopravvivenza cellulare, mentre altri favoriscono l’induzione della morte programmata. Il nostro studio si propone di accertare eventuali variazioni indotte dall’ inibitore del proteasoma bortezomib e dall’ inibitore delle istone deacetilasi SAHA sui livelli dei diversi membri della famiglia Bcl-2. Con particolare interesse accerteremo mediante analisi di western blotting eventuali variazioni del contenuto di Bcl-2 e Bcl-XL, due importanti fattori antiapoptotici che permettono la sopravvivenza degli elementi cellulari. Valuteremo, inoltre, gli effetti del bortezomib e del SAHA sul livello di Bcl-Xs, variante di splicing del gene Bcl-X con funzione proapoptotica. Inoltre, sarà valutato l’effetto dei composti su altri membri della famiglia Bcl-2 con funzione proapoptotica. In particolare accerteremo le eventuali variazioni dei livelli di Bax, sia della forma monomerica inattiva che delle forme oligomeriche attive, nonchè l’attivazione di Bid, evidenziabile dalla comparsa del frammento tronco t-Bid. Infine, saranno analizzate le eventuali modifiche nei livelli delle varie isoforme di Bim (Bim EL, L ed S). 2) Valuteremo, inoltre, mediante analisi di RT-PCR, eventuali variazioni nei livelli degli mRNA dei componenti della famiglia Bcl-2 al fine di accertare se le variazioni nei livelli delle proteine siano da attribuire a nuova sintesi proteica. 3) Poiché è noto che gli inibitori del proteasoma possono esercitare effetti antitumorali in modo sinergico quando impiegati in associazione con altri composti, quali gli inibitori delle istone deacetilasi, valuteremo un possibile sinergismo nell’induzione dell’apoptosi dopo trattamento combinato con bortezomib e SAHA. L’effetto sulla riduzione della vitalità e sull’induzione di apoptosi sarà valutato trattando le cellule con concentrazioni dei composti che risultino scarsamente efficaci quando somministrati da soli. Allo scopo di valutare l’eventuale presenza di un effetto sinergico i dati saranno analizzati mediante il metodo matematico elaborato da Chou and Talalay. 4) Per individuare il meccanismo responsabile dell’interazione sinergica tra bortezomib e SAHA, abbiamo in programma di valutare mediante analisi di western blotting e di RT-PCR eventuali cambiamenti nei livelli di una serie di fattori che esplicano un ruolo nel controllo dell’apoptosi. In particolare valuteremo eventuali cambiamenti indotti dal trattamento combinato con i due composti sui livelli dei membri della famiglia Bcl-2. Inoltre, valuteremo gli effetti dei due composti sui fattori coinvolti nella via di c-Jun/JNK (JNK, c-jun, phospho-c-Jun, AP-1), in considerazione del fatto che, come da noi precedentemente dimostrato, questi fattori giocano un ruolo importante nel meccanismo apoptotico indotto dal bortezomib in cellule di epatoblastoma HepG2.

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    Obiettivi Il nostro progetto di ricerca intende accertare i meccanismi molecolari dell’azione di entrambi i composti nell’ induzione di apoptosi in cellule tumorali epatiche a confronto con linee non tumorali derivate da fegato umano. Inoltre, intendiamo valutare la possibilità di un effetto sinergico tra bortezomib e SAHA in cellule di epatoma ed epatocarcinoma in coltura. Al fine di chiarire le basi molecolari dell’eventuale sinergismo tra i due composti particolare attenzione sarà rivolta al sistema c-Jun/JNK/AP-1 e ai membri della famiglia Bcl-2. Metodologie Gli studi saranno condotti su linee cellulari di epatoblastoma umano HepG2, di epatocarcinoma HuH-6 e HuH7, nonché su una linea di cellule epatiche immortalizzate denominata Chang liver. Come agenti apoptotici impiegheremo l’inibitore del proteasoma bortezomib e l’ inibitore delle istone deacetilasi SAHA. La vitalità cellulare sarà valutata mediante un saggio colorimetrico che impiega il 3-(4,5-dimetiltiazol-2-lil-2,5 difeniltetrazodiobromuro) (MTT), un composto che viene ridotto dalle deidrogenasi mitocondriali, producendo un cromogeno la cui concentrazione è direttamente proporzionale al numero di cellule vive. Desideriamo accertare la comparsa delle caratteristiche morfologiche dell’apoptosi mediante sia microscopia ottica che a fluorescenza, dopo colorazione con acridina orange/etidio bromuro. La condensazione della cromatina sarà valutata mediante colorazione con Hoechst 33258. La distribuzione delle cellule lungo le fasi del ciclo e la percentuale di cellule in apoptosi sarà determinata mediante citometria a flusso dopo colorazione con ioduro di propidio, analizzando i dati mediante il software EXPO32 Il livello delle proteine coinvolte nell’apoptosi sarà valutato con tecniche di western blotting, utilizzando specifici anticorpi. Identiche quantità di proteine saranno sottoposte ad elettroforesi in gel di poliacrilammide in presenza di SDS, trasferite su filtro di nitrocellulosa mediante elettroblotting. Le bande vengono identificate mediante impiego di anticorpi specifici. L’analisi densitometrica dell’intensità delle bande sarà eseguita mediante IMAGE SXM 1.62 Software. L’espressione di geni correlati con l’induzione del processo apoptotico sarà analizzata mediante RT-PCR. Dopo estrazione e purificazione del RNA cellulare, si procederà alla retrotrascrizione degli mRNAs in presenza di trascrittasi inversa e successiva amplificazione del retrotrascritto mediante PCR. Impiegando specifici sets di primers saranno accertate eventuali variazioni nel livello di espressione di alcuni fattori coinvolti nell’apoptosi ed i risultati saranno comparati a quelli ottenuti valutando i geni controllo (GAPDH, beta-actina). L’intensità delle bande sarà quantificata mediante l’impiego di un programma di analisi densitometrica (IMAGE SXM 1.62 Software). Esperimenti di gel-shift permetteranno di studiare la capacità di binding al DNA di AP-1. A questo proposito estratti nucleari di cellule trattate con bortezomib o SAHA saranno incubati in presenza di oligonucleotidi marcati con 32[P], contenenti la sequenza consensus per AP-1. I complessi DNA-proteine saranno sottoposti ad elettroforesi su gel di policrilamide e visualizzati per autoradiografia.
    StatoAttivo
    Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

    Fingerprint

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