Architettura della cromatina e regolazione dell'espressione genica

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Questo progetto di ricerca è la continuazione di quello presentato col programma 2004 ed ha lo scopo di analizzare i cambiamenti dinamici della cromatina durante lo sviluppo embrionale del riccio di mare e nelle cellule eritroidi. Intendiamo continuare l’analisi del posizionamento dei nucleosomi e lo studio dell’isolatore cromatinico sns5 localizzato nel cluster genico degli istoni di riccio di mare. In particolare, intendiamo: 1. Indagare sul ruolo dei nucleosomi nel meccanismo di silenziamento del gene per l'istone H2A. Per tale sopo la cromatina verrà digerita con opportuni enzimi di restrizione per evidenziare la presenza di nuclesomi posizionati sulle sequenze del promotore e dell’enhancer, quando i geni degli istoni sono repressi. 2. Verificare se il cambio della fase translazionale di un nucleosoma eventualmente posizionato sulla TATA box consente la trascrizione di H2A anche nello stadio embrionale in cui il gene endogeno è represso. Per tale scopo, verrà ingegnerizzato il gene H2A di P.lividus inserendo un oligonucleotide tra enhancer e promotore in modo da portare la TATA box sul DNA linker ed eliminare così l’effetto repressivo degli istoni. Tale costruzione plasmidica verrà microiniettata nell’embrione di S. granularis e l’espressione del transgene H2A determinata a differenti stadi di sviluppo. 3. Mappare i fattori modificatori dei nucleosomi reclutati sull'isolatore cromatinico sns 5. Per tale scopo sarà continuata l'analisi della cromatina mediante immuno precipitazione (ChiP) con anticorpi contro l'istone H3 metilato nella lisina 9 e nella lisina 27. 4. Mappare in vivo a livello di cromatina i fattori eritroidi leganti l’isolatore cromatinico sns5. Per tale scopo la cromatina di cellule eritroidi trasdotte con un retrovirus ricombinante isolato dall'elemento sns 5 sarà analizzata mediante Chip con anticorpi specifici.

Layman's description

1. Dimostrare che la repressione del gene per l’istone H2A di riccio di mare dipende dalla presenza di un nucleosoma posizionato sulla TATA box che impedisce il legame del fattore TBP e quindi l’assemblaggio del complesso di trascrizione basale PIC. 2. Dimostrare che il cambio della fase translazionale del nucleosoma pone la TATA box nel DNA linker e consente l’espressione del transgene H2A nello stadio embrionale in cui i geni endogeni sono silenti. 3. Dimostrare che l’isolatore genomico sns5 è coinvolto nella formazione di cromatina silenziata nelle regioni regolative di H2A che presenta i nucleosomi metilati nella lisina 9 e 27. 4. Dimostrare che il mantenimento delle funzioni di sns5 come isolatore nella cromatina di cellule eritroidi dipende dal legame specifico di fattori proteici che reclutano del complessi che mantengono la cromatina in uno stato aperto compatibile con la trascrizione. Embrioni di riccio di mare a vari stadi di sviluppo e cellule in coltura MEL della linea eritroide trasdotte con retrovirus fiancheggiato dall’elemento sns5, verranno trattati con formaldeide per indurre legami crociati (cross-linking) tra DNA e proteine e proteine – proteine. La cromatina verrà preparata e soggetta a sonicazione o trattamento enzimatico con la nucleasi micrococcale. Per il mammaggio dei nucleosomi, la cromatina verrà digerita con enzimi di restrizione i cui siti sono localizzati nella regione promotore enhancer del gene H2A. Per gli esperimenti di immunoprecipitazione, la cromatina verrà incubata con anticorpi contro la lisina 9 o 27 dell’istone H3, anti-acetilasi, anti de-acetilasi e anti istone-metilasi. Dopo reversione del cross-linking il DNA verrà purificato dalla cromatina immunoprecipitata e mediante PCR verrano amplificate le sequenze del promotore e dell'isolatore sns5. Per il mappaggio dei nucleosomi, il DNA verrà purificato dalla cromatina digerita con enzimi di restrizione e analizzato direttamente o sottoposto a ulteriore digestione con un secondo enzima. I frammenti di DNA saranno analizzati mediante southern blot e marcatura terminale indiretta della cromatina. La costruzione di plasmidi per la microiniezione verrà effettuata secondo protocolli standardizzati d’ingegneria genetica.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

Fingerprint

Esplora i temi di ricerca toccati da questo progetto. Queste etichette sono generate sulla base dei riconoscimenti/sovvenzioni sottostanti. Insieme formano una fingerprint unica.