Apoptosi e stress nello sviluppo embrionale

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Gli studi sull’apoptosi, un programma genetico di morte cellulare, saranno condotti su 1) cellule di embrioni di riccio di mare esposti a metalli pesanti; 2) su cellule umane del cumulo ooforo. 1) Abbiamo recentemente dimostrato che negli embrioni di P. lividus sottoposti a trattamento con 1mM CdCl2 si verifica l’insorgenza di aberrazioni e ritardi nello sviluppo, inoltre aumentando il tempo di esposizione al metallo si determinano malformazioni progressivamente più evidenti. Abbiamo anche dimostrato che il cadmio è in grado di indurre un’evidente frammentazione del DNA, sintomatica di eventi apoptotici, in maniera proporzionale alla concentrazione di metallo presente nel mezzo di coltura e al periodo di trattamento. La capacità degli embrioni di accumulare lo ione cadmio nel tempo fa ipotizzare che anche a basse concentrazioni questo metallo possa determinare effetti citotossici. Si intende procedere alla stima della possibile tossicità indotta da basse concentrazioni di cadmio negli stessi embrioni. Si vogliono studiare i fenomeni di apoptosi implicati e la loro regolazione endogena in risposta ai trattamenti, cioè definire in che modo il segnale di morte sia avviato e si produca. Saranno pertanto valutati gli effetti nocivi prodotti sulle larve di P. lividus da esposizioni prolungate ma a concentrazioni più simili a quelle che si possono riscontrare nelle acque contaminate. Sarà ricostruita la cascata molecolare che conduce la cellula all’apoptosi: saranno esaminate le molecole generalmente utilizzate nella via estrinseca e/o nella via intrinseca. Saranno valutati, e messi a confronto, gli effetti provocati da altri metalli pesanti. 2) Abbiamo recentemente dimostrato che esiste una corrispondenza tra lo stato delle cellule del cumulo ooforo e i relativi oociti, in pazienti sottoposte a terapia di stimolazione ovarica nei programmi di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA). Si intende verificare se eventi apoptotici in atto nelle cellule del cumulo possano determinare una qualità non idonea alla selezione del corrispondente oocita. In tal caso saranno messi a punto rapidi tests per individuare opportuni markers apoptotici nelle cellule del cumulo ooforo al fine di consentire una migliore selezione degli oociti da fecondare.

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Lo studio dell’apoptosi proseguirà nei due differenti modelli: 1) negli embrioni di riccio di mare esposti a ioni cadmio; 2) nelle cellule umane del cumulo ooforo. Obiettivo 1) : Comprendere come/quanto l’accumulo del cadmio inneschi processi apoptotici nelle cellule embrionali e larvali di Paracentrotus lividus. La stima quantitativa del cadmio assimilato sarà condotta mediante spettrometria di assorbimento atomico. Sarà indagato se anche basse concentrazioni di cadmio, dell’ordine di 1µM, 1nM, 1pM, somministrate per prolungati periodi, possano causare nelle larve apoptosi, paragonabile a quella suscitata negli embrioni da concentrazioni elevate e brevi periodi di esposizione. Sarà pertanto necessario ricostruire in laboratorio le condizioni necessarie allo sviluppo larvale, fino alla metamorfosi. Sarà valutato se e in quale misura gli embrioni o le larve siano in grado di ripristinare, almeno in parte, il proseguo dello sviluppo, quando venga allontanato il cadmio dall’acqua di mare (esperimenti di recovery). Si vogliono studiare i fenomeni di apoptosi implicati e la loro regolazione endogena in risposta ai trattamenti con cadmio, cioè definire in che modo il segnale di morte sia avviato e si trasmetta. Sarà anche saggiata la variazione di potenziale di membrana mitocondriale e saranno condotti esperimenti per mostrere le eventuali aberrazioni prodottesi nel sistema respiratorio della cellula. Saranno identificate le molecole coinvolte nella cascata apoptotica. Obiettivo 2): Scopo dello studio è quello di valutare la percentuale di apoptosi nelle cellule del cumulo ooforo di ogni singolo oocita recuperato da pazienti sottoposte a tecniche di PMA al fine di correlarla alla qualità oocitaria. Infatti, come sopra riportato, la presenza di processi apoptotici in atto in queste cellule in genere si riflette sullo stato del corrispondente oocita. Ciò potrebbe consentire di utilizzare la percentuale apoptotica riscontrata come un marker molecolare da aggiungere ai parametri morfologici per la selezione dei tre (e non più di tre, come da legge n. 40 del 19/02/2004) migliori oociti da inseminare.1) Negli embrioni di riccio di mare: -Verrà impiegata la spettrometria di assorbimento atomico per analizzare la quantità di cadmio accumulata negli embrioni e nelle larve, per le diverse concentrazioni di cadmio utilizzate e i diversi tempi di trattamento. Nel caso di esperimenti di “recovery” sarà anche misurata la quota di cadmio che permane all’interno delle cellule dopo rimozione del cadmio, a vari tempi. -Saggi Tunel verranno utilizzati per valutare i danni prodotti al livello del DNA da basse concentrazioni di cadmio e tempi di trattamento prolungati. -Esperimenti di Western blot e immunocitochimica saranno condotti nelle fasi larvali successive allo stadio di pluteo, saggiando le principali molecole implicate nella cascata apoptotica, sia della via estrinseca che intrinseca (utilizzando opportuni anticorpi, eterologhi). -Il frazionamento cellulare ed il subfrazionamento mitocondriale permetteranno di studiare e localizzare l’espressione di alcune proteine potenzialmente responsabili dell’innesco del processo di apoptosi, del suo attuarsi e concludersi. 2) Nelle cellule umane del cumulo ooforo: -Per le cellule del cumulo ooforo isolate da singolo oocita (le cellule saranno fornite dal Centro di Biologia della Riproduzione di Palermo) sarà utilizzata una speciale procedura che prevede: la fissazione e la stratificazione di tali cellule tramite speciale citocentrifugazione. -Sarà utilizzato uno specifico saggio per evidenziare l’eventuale frammentazione del DNA (TUNEL), in situ, nelle cellule del cumulo. -Esperimenti di immunoistochimica con specifici anticorpi verrano adoperati per confermre la cascata di attivazione enzimatica che provoca la morte cellulare, nelle cellule del cumulo positive al saggio TUNEL. -Verrà calcolata la percentuale di apoptosi riscontrata nelle cellu
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/06 → …

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