Apoptosi e stress nello sviluppo embrionale

Progetto: Research project

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Lo studio dell’apoptosi, programma genetico di morte cellulare responsabile dell’eliminazione di singole cellule in particolari condizioni sia di stress sia fisiologiche, sarà affrontato in due differenti modelli: a) negli embrioni di riccio di mare esposti a ioni cadmio; b) nelle cellule umane del cumulo ooforo. a) Saranno condotti esperimenti per appurare se l'esposizione a ioni cadmio determini morte cellulare di tipo apoptotico negli embrioni di riccio di mare. In caso positivo, si procederà con l'identificazione delle molecole responsabili della cascata apoptotica. L’insieme dei risultati permetterà di stabilire se un prolungato stress da cadmio sia causa di suicidio cellulare. b) Si accerterà se esiste una corrispondenza tra lo stato delle cellule del cumulo ooforo e i relativi oociti, in pazienti sottoposte a terapia di stimolazione ovarica nei programmi di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA). Sarà pertanto analizzato il tasso di apoptosi di tali cellule, per verificare se l’assenza di apoptosi possa essere riconducibile ad una migliore qualità oocitaria. In tal caso, si cercherà di mettere a punto rapidi tests per individuare markers apoptotici nelle cellule del cumulo, e/o della granulosa, per consentire una più idonea scelta degli oociti da fecondare, in quanto attualmente gli oociti vengono selezionati esclusivamente tramite parametri morfologici. Saranno utilizzate le metodologie prima sperimentate nel modello di studio riccio di mare.

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Lo studio dell’apoptosi, programma genetico di morte cellulare responsabile dell’eliminazione di singole cellule in particolari condizioni o di stress, o fisiologiche, sarà affrontato in due differenti modelli: a) negli embrioni di riccio di mare esposti a ioni cadmio; b) nelle cellule umane del cumulo ooforo. Obiettivo a: Appurare se l'esposizione a ioni cadmio determini morte cellulare di tipo apoptotico negli embrioni di riccio di mare. Verificare l'eventuale coinvolgimento della caspasi-3, una proteasi effettrice che porta irreversibilmente all’esecuzione del programma di morte. A conferma, verificare se l’espressione della pro-caspasi-3 (zimogeno) diminuisca progressivamente all’aumentare del tempo di trattamento. Parallelamente saggiare l’attivazione di Fodrina, di lamina A, di PARP, substrati diretti o indiretti della caspasi-3. Identificare le principali caspasi coinvolte nella cascata apoptotica. L’insieme dei risultati permetterà di stabilire se un prolungato stress da cadmio sia causa di suicidio cellulare. Obiettivo b: Verificare se esiste una corrispondenza tra lo stato delle cellule del cumulo ooforo e i relativi oociti, in pazienti sottoposte a terapia di stimolazione ovarica nei programmi di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA). Poichè le cellule del cumulo ooforo sono altamente sensibili al processo apoptotico, si intende analizzare il tasso di apoptosi di tali cellule per verificare se l’assenza di apoptosi possa essere riconducibile ad una migliore qualità oocitaria. In tal caso, si cercherà di mettere a punto rapidi tests per individuare markers apoptotici nelle cellule del cumulo, e/o della granulosa, per consentire una più idonea scelta degli oociti da fecondare, poichè attualmente questi vengono selezionati esclusivamente tramite parametri morfologici. Metodologie a) La possibilità che il trattamento con cadmio determini morte cellulare per apoptosi sarà saggiata mediante TUNEL. Verrà verifiato se gli embrioni trattati per tempi superiori a 24 ore mostrino un’elevata entità della frammentazione del DNA, evento peculiare dell’apoptosi. Attraverso esperimenti di Western blot e immunoistochimica (in embrioni interi) verrà saggiato il coinvolgimento della caspasi-3, una proteasi effettrice che porta irreversibilmente all’esecuzione del programma di morte. Allo stesso modo, saranno saggiate le principali molecole implicate nella cascata apoptotica, sia della via estrinseca che intrinseca. b) Sarà sperimentata una particolare procedura sulle cellule della granulosa e del cumulo, isolate per singolo oocita (le cellule saranno fornite dal Centro di Biologia della Riproduzione di Palermo) che prevede: la fissazione e la stratificazione di tali cellule tramite citocentrifugazione; l’uso di uno specifico saggio per evidenziare l’eventuale frammentazione del DNA in situ (TUNEL). In caso di reazione positiva, con esperimenti di immunoistochimica si procederà con l’identificazione delle molecole chiave nella cascata di attivazione enzimatica che provoca la morte cellulare. La messa a punto di tests immunologici di tale tipo potrebbe consentire di identificare, rapidamente, le cellule che hanno in corso un processo apoptotico. Saranno utilizzate le metodologie da noi stessi sperimentate, in precedenza, nel modello di studio riccio di mare.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/04 → …

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