Apoptosi e stress nello sviluppo embrionale

Progetto: Research project

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Proseguiranno le ricerche sull’apoptosi, un programma genetico di morte cellulare responsabile dell’eliminazione di singole cellule in particolari condizioni, sia fisiologiche sia di stress. Lo studio sarà affrontato in due differenti modelli: * negli embrioni di riccio di mare esposti a ioni cadmio; ** nelle cellule umane del cumulo ooforo.
* Saranno condotti esperimenti per appurare in quale misura prolungate esposizioni a ioni cadmio determinino morte cellulare di tipo apoptotico, negli embrioni di riccio di mare. Si vuole studiare la regolazione endogena dell’apoptosi in risposta alla durata dei trattamenti; in seguito, si procederà con l'identificazione delle molecole responsabili della cascata apoptotica. L’insieme dei risultati permetterà di stabilire se un prolungato stress da cadmio sia causa di suicidio cellulare.
** Si accerterà se esiste una corrispondenza tra lo stato delle cellule del cumulo ooforo e i relativi oociti, in pazienti sottoposte a terapia di stimolazione ovarica nei programmi di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA). Sarà pertanto analizzato il tasso di apoptosi di tali cellule per verificare se l’assenza di apoptosi possa essere riconducibile ad una migliore qualità oocitaria. In tal caso, si cercherà di mettere a punto rapidi tests per individuare markers apoptotici nelle cellule del cumulo, al fine di consentire una più idonea scelta degli oociti da fecondare. Attualmente, infatti, gli oociti vengono selezionati esclusivamente tramite parametri morfologici. Per questo tipo di indagini saranno utilizzate analoghe metodologie già sperimentate nel modello di studio riccio di mare.

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Lo studio dell’apoptosi proseguirà nei due differenti modelli: * negli embrioni di riccio di mare esposti a ioni cadmio; ** nelle cellule umane del cumulo ooforo.
Obiettivo *: Capire i meccanismi legati alla dinamica di assimilazione del cadmio negli embrioni di Paracentrotus lividus. La stima quantitativa del cadmio assimilato passivamente dagli embrioni di riccio di mare sarà condotta mediante spettrometria di assorbimento atomico. In questa fase preliminare del progetto si intende utilizzare una concentrazione di cadmio molto elevata (10-3 M), per poter ottenere dei risultati apprezzabili e significativi con brevi periodi di trattamento. Sarà calcolata la quantità di cadmio assimilata dagli embrioni di P. lividus in un arco temporale compreso tra le 9 e le 40h di esposizione. Saranno condotti esperimenti di “recovery” sugli embrioni prima trattati con la concentrazione citotossica del metallo e poi lasciati sviluppare in condizioni fisiologiche. Sarà verificata l’entità dell’eventuale espulsione del metallo da parte degli embrioni, pertanto sarà analizzata la quantità di cadmio presente all’interno degli embrioni e nel mezzo di coltura.
Si vogliono studiare i fenomeni di apoptosi implicati e la loro regolazione endogena in risposta ai trattamenti, cioè definire in che modo il segnale di morte sia avviato e si trasmetta. Sarà indagato se anche basse concentrazioni di cadmio, dell’ordine di 10-6 e 10-7 M, somministrate per prolungati periodi, possano causare una risposta da stress negli embrioni, paragonabile a quella suscitata da concentrazioni elevate e brevi periodi di esposizione. Sarà pertanto necessario ricostruire in laboratorio le condizioni sufficienti e necessarie al proseguo dello sviluppo embrionale del P. lividus fino alla metamorfosi larvale.
Stabiliti i parametri di lavoro più idonei, sarà vagliata l’attivazione dei meccanismi apoptotici indotti dal cadmio, poiché già alcuni dati preliminari hanno suggerito che la morte programmata può essere attivata da concentrazioni citotossiche di questo elemento.
Obiettivo **: Lo scopo dello studio è quello di verificare se la qualità oocitaria sia corrispondente a quella delle cellule del cumulo ooforo (che possono essere utilizzate a fini sperimentali), studiando l’integrità genetica delle cellule del cumulo in pazienti sottoposte a terapia di stimolazione ovarica nei programmi di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA). Poichè le cellule del cumulo ooforo sono altamente sensibili al processo apoptotico, si intende analizzare il tasso di apoptosi di tali cellule. L’obiettivo è quello di mettere a punto tests (da eseguire rapidamente) per individuare alcuni markers apoptotici nelle cellule del cumulo, al fine di scartare gli oociti corrispondenti a quelle con processi apoptotici in corso. Ciò consentirebbe una più idonea scelta degli oociti da fecondare; infatti attualmente gli oociti vengono selezionati esclusivamente secondo parametri morfologici.
Metodologie
* Negli embrioni di riccio di mare:
• La spettrometria di assorbimento atomico verrà impiegata per analizzare la quantità di cadmio presente all’interno degli embrioni, per i diversi tempi di trattamento. Nel caso di esperimenti di “recovery” sarà anche misurata la quota di cadmio rilasciata nel mezzo di coltura.
• Verranno ricercate le condizioni di laboratorio più idonee per il proseguimento dello sviluppo larvale del P. lividus, fino alla metamorfosi, al fine di poter prolungare i periodi di esposizione utilizzando basse concentrazioni di cadmio (10-6 e 10-7 M) e salvaguardando la sopravvivenza delle larve.
• Saggi Tunel verranno utilizzati per valutare i danni prodotti al livello del DNA da basse concentrazioni di cadmio e per tempi di trattamento prolungati.
• Esperimenti di Western blot e immunocitochimica (in embrioni interi) serviranno a stimare l’espressione della cisteino-proteasi caspasi 3, ef
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

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