Analoghi dell'adenosina in terapia di combinazione per il trattamento dei tumori

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L’identificazione di nuovi farmaci antitumorali è uno degli scopi più rilevanti della attuale ricerca oncologica. Infatti, la maggior parte delle neoplasie presenta già alla diagnosi o acquisisce nel corso della sua storia naturale delle caratteristiche biologiche che determinano resistenza ai trattamenti chemioterapici oggi disponibili. In prove precedenti, l’utilizzazione del nuovo antimetabolita, analogo dell’adenosina e inibitore della ribonucleotide reduttasi, 3’-metiladenosina (3’-MeAdo) ha dimostrato una significativa attività citotossica e apoptotica in cellule tumorali ematologiche, essendo capace di attivare la via mitocondriale intrinseca dell’apoptosi. Scopo del presente studio sarà di individuare nuove possibili combinazioni sinergiche tra 3’-MeAdo e molecole dotate di diversi meccanismi d’azione come i retinoidi (acido all-transretinoico, acido isoxazolobenzoico) e gli inibitori dell’istone deacetilasi (HDAC), tutti composti che hanno dimostrato di modulare diversi pathway molecolari critici per la sopravvivenza e la differenziazione cellulare. Quindi si saggeranno diverse combinazioni su linee cellulari tumorali sensibili o resistenti all’effetto citotossico e/o apoptotico dei farmaci tradizionali (cellule multifarmaco resistenti, portatori di mutazione del recettore di morte Fas, mancanti dell’enzima deossicitidina chinasi, ecc.) al fine di evidenziare possibili interazioni di tipo sinergico, mettendole anche in relazione con la sequenza di esposizione. Si procederà quindi a studiare i meccanismi alla base delle interazioni osservate e in particolare il coinvolgimento di varie molecole ad attività apoptotica (fas, caspasi, ROS, ecc.) o antiapoptotica (IAP, bcl2, NF-kB, ecc.) o dei pathway che regolano il ciclo cellulare (p21, ecc.) da parte delle sostanze singole e in associazione. I risultati ottenuti potranno essere utilizzati per ottimizzare ulteriormente le associazioni e definire dei protocolli da sperimentare in futuri studi in vivo.

Layman's description

Il presente studio si propone di valutare gli effetti in vitro delle combinazioni della 3’-metiladenosina con alcuni composti retinoidi quali l’acido all-transretinoico (ATRA) e l’acido isoxazolobenzoico (MC18) o inibitori dell’HDAC come l’acido suberoilanilide idrossamico (SAHA) e i nuovi composti MC1864 e MC1879. I risultati saranno confrontati con quelli ottenuti con il composto di riferimento Fludarabina. Gli obiettivi saranno: 1) identificare il tipo di interazione farmacologica tra le varie sostanze (additiva, sinergica positiva o negativa) mettendola in relazione con la modalità di trattamento (contemporanea o sequenziale). 2) Valutare i possibili meccanismi alla base di tali interazioni. In particolare si studierà il coinvolgimento di varie molecole ad attività apoptotica o antiapoptotica o dei pathway che regolano il ciclo cellulare nell’azione delle sostanze singole e in associazione. 3) Evidenziare possibili effetti terapeutici positivi delle combinazioni in cellule tumorali caratterizzate da diversi meccanismi di resistenza agli agenti antitumorali. Cellule tumorali in coltura, come la linea di leucemia a promielociti HL60, la linea di leucemia mieloide cronica K562, la linea di linfoma umano a cellule T HuT78 saranno esposte ai farmaci in associazione a diverse concentrazioni e con diverse sequenze di trattamento, valutando l’effetto citotossico e apoptotico. La citotossicità sarà determinata utilizzando il test di esclusione al Trypan blue, mentre la capacità a indurre apoptosi sarà studiata mediante microscopia a fluorescenza e/o citofluorimetria a flusso. L’interazione farmacologica sarà valutata calcolando l’indice di combinazione che risulta dal rapporto tra l’effetto ottenuto con la combinazione e quello dei singoli farmaci secondo il metodo del prodotto frazionale di Webb e/o isobologramma. Le prove saranno inoltre ripetute su linee cellulari resistenti agli effetti citotossici e/o apoptotici dei farmaci quali la linea HL60R dotata di multifarmaco resistenza e resistente all’apoptosi indotta da svariati agenti, le linea HuT78R2 resistente alla gemcitabina a causa di ridotti livelli dell’enzima deossicitidina chinasi, la linea HuT78B1 resistente all’apoptosi indotta da Fas-ligando in quanto portatrice di una mutazione del recettore fas. In tal modo si potrà valutare l’eventuale attività terapeutica delle combinazioni anche su tumori resistenti. Quindi, si procederà studiando l’effetto delle combinazioni sulla distribuzione delle cellule tumorali nella varie fasi del ciclo cellulare mediante l’uso della citofluorimetria a flusso. Inoltre, per valutare il tipo di pathway biochimico attivato si valuterà l’attivazione delle caspasi mediante test colorimetrico e/o immunoblotting, la modificazione del potenziale di membrana mitocondriale (delta-psi) utilizzando il colorante fluorescente DiOC6 in citofluorimetria, l’espressione delle proteine inibitorie dell’apoptosi IAP, delle proteine della famiglia bcl2 e dell’inibitore del ciclo p21 mediante western blotting, la modifica dei livelli intracellulari di NFkB attivato mediante un test ELISA-simile, la produzione di ROS mediante citofluorimetria. Si studierà anche la capacità di inibitori specifici della via estrinseca e intrinseca dell’apoptosi come l’anticorpo anti-Fas ZB4, gli inibitori delle caspasi 8 (Z-IETD), 9 (Z-LEHD) e 3 (Z-DEVD e Z-VAD), nonché di inibitori di NF-kB (MG132) e di antagonisti dei recettori per l’adenosina (VUF5574) di influenzare l’effetto apoptotico e antiproliferativo delle associazioni.
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/05 → …

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