Analisi epigenetiche di oncogeni e oncosoppressori coinvolti nella cancerogenesi in linee cellulari tumorali e campioni di sangue/plasma

Progetto: Research project

Dettagli progetto

Description

Da anni il nostro gruppo di ricerca studia il meccanismo d’azione di agenti che rimodellano la cromatina dimostrando che tanto gli inibitori della PARP (come la 3-aminobenzamide) che gli inibitori delle deacetilasi istoniche (SAHA, tricostatina A, ITF2357), inducono selettivamente morte per apoptosi in cellule tumorali in coltura. Recentemente ci siamo proposti di identificare modifiche epigenetiche caratterizzanti l’insorgenza e la progressione di specifici tumori. Particolare attenzione è stata rivolta alla metilazione del promotore di geni e alle modifiche covalenti degli istoni che favoriscono l’espressione di geni responsabili della cancerogenesi. Il progetto presentato intende: Caratterizzare i profili di metilazione in cellule tumorali e in DNA estratto da plasma o siero di pazienti sani o portatori di tumore. Per individuare loci genici con variazioni nello stato di metilazione condurremo studi comparativi in cellule di tumori umani in coltura e in campioni ematici prelevati da individui sani e da portatori di tumori pancreatici, epatici, mammari o colorettali. In particolare valuteremo: oncogeni (Myc, c-Fos e ki-Ras), geni oncosoppressori (WIF1K; DKK3; Rb, TP73; TP16; TP14; TP15; p27Kip1; FHIT, HIC1) geni coinvolti nei meccanismi di riparo del DNA (GST-pi, hMLH1, MGMT e BRCA1); geni coinvolti nei meccanismi di invasività e metastasi (DAPK; Betaig-h3;CD44; CLDN3; CLDN5; COX2; CSPG2; CX26; TIMP3; THBS1; SPARC; ST14;TJP2; TWIST1). Per ciascun gene analizzato si studierà il pattern di metilazione, considerando il rapporto tra l’intensità delle bande metilate e non metilate. Le analisi di metilazione saranno condotte mediante tecnica MSP, una metodica di studio qualitativa per valutare lo stato di metilazione delle isole CpG. Dopo l’estrazione, il DNA genomico verrà trattato con bisulfito. I prodotti metilati e non metilati ottenuti mediante PCR saranno poi analizzati mediante sequenziamento genico. Per quantificare i profili di metilazione saranno condotte analisi di Real Time PCR. Per ciascun paziente analizzato i dati saranno rapportati alla tipologia di cancro, allo stato epidemiologico, all’incidenza territoriale e alla familiarità. I risultati potrebbero consentire di caratterizzare le modifiche epigenetiche indici di suscettibilità al cancro. Caratterizzare modifiche epigenetiche degli istoni associate alla tumorigenesi. Le modifiche post-traduzionali degli istoni come acetilazione, metilazione, fosforilazione, ADP-ribosilazione costituiscono il “codice istonico” e possono variamente modulare la dinamica della cromatina e l’espressione genica. Valuteremo i pattern di modifiche epigenetiche degli istoni e le possibili correlazioni tra tali modifiche e lo sviluppo di specifici tumori. Gli istoni saranno purificati da linee cellulari di tumore al pancreas, al colon, al fegato e alla mammella e mediante impiego di anticorpi specifici, si identificheranno i residui amminoacidici target di tali modifiche.

Layman's description

Obiettivi L’osservazione che nei pazienti malati di cancro la quantità di DNA circolante è maggiore rispetto agli individui sani, ha dato inizio alla ricerca sugli acidi nucleici circolanti e alla loro caratterizzazione molecolare. L’obiettivo di questo progetto è l’individuazione di nuovi indicatori tumorali per monitorare il loro coinvolgimento nella tumorigenesi. Linee cellulari derivanti dai più frequenti tumori maligni e DNA circolante estratto da campioni di plasma o siero di soggetti portatori di tumore saranno impiegati per identificare un pannello di geni coinvolti in modifiche epigenetiche predittive di tumori. I dati acquisiti consentiranno in tal modo di costruire una “mappa epigenetica” relativa alle alterazioni responsabili della carcinogenesi. E’ possibile immaginare che tale mappa possa essere rappresentata da alterazioni precognitrici di trasformazione generale e da alterazioni specifiche per ciascun tipo di cancro. Verranno valutati geni oncosoppressori, per i quali è previsto un silenziamento dovuto a ipermetilazione delle isole CpG presenti nei promotori dei geni, e oncogeni la cui espressione è soggetta a controllo mediante ipometilazione. Lo studio ha anche l’obiettivo di individuare un certo numero di geni la cui espressione è modulata da modifiche epigenetiche che riguardano le proteine istoniche, come ad esempio metilazione, acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione, sumoilazione, ADP-ribosilazione. Le informazioni acquisite con l’approccio sperimentale proposto potrebbero permettere di definire condizioni per il design di terapie antitumorali specifiche per ogni tipo di tumore. Se il progetto avesse successo sarebbe possibile individuare, in maniera veloce e non invasiva, l’eventuale predisposizione, per condizioni ambientali o familiari, ad un determinato tipo di tumore. La caratterizzazione biologica di specifici tumori quali ad esempio il tumore al pancreas, al coloretto, al fegato o alla mammella consentirà di integrare in maniera sempre più consistente il profilo molecolare di ciascun tumore con la diagnosi morfologica tradizionale. Questa innovazione diagnostica potrebbe favorire l'individuazione di pazienti potenzialmente responsivi a differenti trattamenti radio e/o chemioterapici, mentre i pazienti predittivamente resistenti potrebbero essere indirizzati alla valutazione dell'efficacia di trattamenti innovativi e/o di nuovi farmaci antiblastici. E’ possibile ritenere che il progetto proposto possa avere un impatto notevole sul sistema sanitario nazionale (SSN) fornendo al cittadino un servizio utile e necessario a fronte della continua richiesta di intervento per cercare di combattere il cancro. Metodologie Le analisi saranno condotte in linee cellulari di carcinoma mammario (MDA-MB231, MCF7, HTB125), carcinoma pancreatico (MiaPaCa2, Panc1), epatoblastoma (HepG2, Hep3B), carcinoma colorettale (HT29, HCT116). Linee cellulari controllo saranno impiegate per comparare i risultati ottenuti. I campioni di sangue saranno prelevati da soggetti sani e pazienti con cancro al pancreas, al coloretto, al fegato e alla mammella, dopo richiesta del consenso informato. Il DNA verrà isolato mediante il kit QIAamp DNA Blood (Qiagen). Per valutare lo stato di metilazione del DNA sarà impiegata la tecnica della modificazione con bisolfito che permette di evidenziare anche limitate quantità di DNA metilato. La tecnica è stata messa a punto nel nostro laboratorio, utilizzando standard di reazioni con DNA di cellule normali e tumorali; come controllo della specificità della metodica è stato utilizzato DNA commerciale che presenta metilazione di tutti i dinucleotidi CG. Il metodo con bisolfito consente di deaminare la citosina in uracile. Poiché la metilazione protegge la citosina dalla modificazione non si ha modificazione nelle isole CpG di geni con promotore metilato. L’identificazione delle regioni metilate del DNA sarà effettuata mediante MS
StatoAttivo
Data di inizio/fine effettiva1/1/07 → …

Fingerprint

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