Analisi delle modificazioni proteomiche plasmatiche in pazienti con Sclerosi Multipla ricorrente-remittente sottoposti a trattamento con natalizumab

Pazienti con Sclerosi Multipla (SM) di tipo ricorrente remittente, in procinto di iniziare il trattamento con l’anticorpo monoclonale umanizzato natalizumab, saranno sottoposti, previa firma di consenso informato, ad un prelievo ematico per ottenere un campione di plasma. Il loro stato clinico sarà determinato tramite il punteggio di disabilità (EDSS) ed il punteggio di gravità della SM (MSSS). Le loro lesioni encefaliche saranno valutate tramite RMN encefalo con gadolinio. Un mese dopo l’inizio del trattamento e dopo ulteriori dodici mesi, si otterranno due nuovi campioni di siero. Al momento di ogni infusione di natalizumab lo stato clinico dei pazienti sarà rivalutato tramite EDSS ed MSSS. Dopo sei e dodici mesi di trattamento i pazienti eseguiranno una RMN encefalo con gadolinio. I campioni plasmatici di ogni paziente saranno analizzati con metodica proteomica bidimensionale (prima dimensione separazione di complessi macromolecolari, seconda dimensione separazione delle proteine denaturate sulla base del peso molecolare). I tracciati proteomici ottenuti saranno valutati con lo scopo di determinare le modificazioni dei pattern proteici plasmatici causate a breve ed a lungo termine dal trattamento con natalizumab e con l’obiettivo di definire eventuali pattern proteomici associabili con una limitata risposta clinica a tale trattamento.

OBIETTIVI: Il presente progetto, condotto su pazienti con Sclerosi Multipla di tipo ricorrente remittente in terapia con natalizumab, si pone i seguenti due obiettivi principali: 1) identificare, tramite ripetute analisi proteomiche, le modificazioni dei pattern proteici plasmatici causate a breve e lungo termine dal trattamento con natalizumab; 2) definire eventuali pattern proteomici associabili con una limitata risposta clinica al trattamento.
METODI: Selezione dei pazienti: Venti pazienti con Sclerosi Multipla (SM) di tipo ricorrente remittente che, nonostante un trattamento di almeno un anno con farmaci immunomodulatori o immunosoppressori, continueranno a presentare almeno due riacutizzazioni cliniche all’anno saranno selezionati per iniziare un trattamento con natalizumab. Il nuovo trattamento potrà essere iniziato dopo almeno un mese di sospensione della terapia immunomodulante o di un’eventuale terapia steroidea praticata per una riacutizzazione clinica e dopo almeno tre mesi di sospensione della terapia immunosoppressiva, come stabilito nei criteri di somministrazione di tale terapia formulati dall’ Agenzia Italiana del Farmaco. Protocollo di somministrazione del natalizumab: prima di iniziare il trattamento con natalizumab e ad ogni infusione lo stato di disabilità dei pazienti sarà determinato tramite la scala di disabilità di Kurtzke (EDSS) ed il grado di progressione tramite il Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS). I pazienti eseguiranno inoltre una RMN encefalo con gadolinio all’inizio delo trattamento e dopo ogni sei mesi di infusioni. Il trattamento prevederà la somministrazione di 300 mgr di natalizumab per via endovenosa ogni 28-30 giorni. Prima della prima e della seconda infusione e dopo un anno di trattamento sarà raccolto un campione di plasma da conservare a –80° C. per le successive analisi proteomiche. Analisi proteomiche: Le proteine, ottenute dal plasma dei pazienti con SM ai tempi zero, 1 mese e 12 mesi saranno utilizzate per le analisi proteomiche come di seguito: la prima dimensione sarà eseguita tramite un sistema di gel non denaturante a bassa concentrazione che separi i complessi macromolecolari. Per la seconda dimensione, le striscie saranno denaturate e separate usando un gel verticale ed un gradiente lineare di poliacrilamide 9-16% (SDS-PAGE). Le proteine saranno visualizzate successivamente con la metodica del nitrato d’argento, i gel analizzati con un densitometro e le immagini valutate con il software ImageMaster 2D Platinum 6.0 (GE Healthcare). Le mappe di riferimento per i sieri umani normali saranno importate nei files sperimentali tramite il server proteomico exPaSy (sistema esperto di analisi proteica) ed utilizzati per l’identificazione delle proteine. Per caratterizzare le proteine, le macchie d’interesse saranno ritagliate dai gel, digerite enzimaticamente usando la tripsina ed analizzate con uno spettrometro di massa MALDI-TOF. I pattern proteomici osservati al tempo 1 mese e 12 mesi saranno confrontati con i pattern basali e tra loro per determinare le variazioni a breve e lungo termine indotte dal natalizumab. Dopo dodici mesi di terapia, sulla base della storia clinica e delle valutazioni di RMN, si identificheranno i pazienti non rispondenti al trattamento e si confronteranno i pattern proteomici ottenuti con quelli osservati nei pazienti rispondenti al trattamento per evidenziare eventuali differenze.