Analisi della variazione del numero di copie geniche nella linea germinale di pazienti con adenocarcinoma pancreatico sporadico

Il decorso accelerato del cancro pancreatico è , in gran parte , il risultato di una diagnosi ad uno stadio avanzato nella maggior parte dei pazienti. Il cancro pancreatico è caratterizzato da modificazioni nell’espressione genica dovute a mutazioni, delezioni, e amplificazioni così come alterazioni nella metilazione del DNA su geni fondamentali per lo sviluppo e la progressione del tumore. L’ identificazione di individui a rischio di sviluppo di adenocarcinoma pancreatico potrebbe essere utile per migliorare la prognosi di questa malattia . Ad oggi non c’è nessun indicatore biologico o genetico capace selezionare pazienti ad alto rischio di cancro pancreatico. Il nostro principale obiettivo sarà identificare CNVs (copy number variations) comuni a tutti i pazienti con cancro pancreatico sporadico allo scopo di identificare SNP probes con segnale anormale di ibridazione nel DNA di tali pazienti. Lo scopo del nostro studio sarà verificare se geni associati al cancro sono amplificati in tutti i pazienti e se geni implicati nello sviluppo del cancro sono presenti in singola copia nel genoma degli stessi. L’identificazione di geni implicati nei CNVs di pazienti con cancro pancreatico sporadico potrebbe essere utile per scopi dignostici, per comprendere la fisiopatologia di questo cancro ed eventualmente utilizzare questi geni come target in strategie terapeutiche . Il set di CNVs potrebbe aiutare a comprendere la fisiopatologia di questa malattia poichè delezioni geniche o duplicazioni generano sbilanciamenti nel corrispondente mRNA e nei livelli di proteine codificate. Per geni e pathways in cui la quantità di un prodotto funzionale è critica , sembra probabilmente che i CNVs potrebbero rappresentare variazioni individuali nella suscettibilità alla malattia. Una migliore conoscenza dei pathways implicate nel cancro pancreatico sporadico può eventualmente permettere lo sviluppo di strategie terapeutiche più efficienti. Il set di CNV potrebbe aiutare a selezionare individui con una predisposizione genetica al cancro pancreatico sporadico.

L’obiettivo del nostro studio sarà identificare variazioni nel numero di copie (CNVs) nel DNA di leucociti di 90-120 pazienti con adenocarcinoma pancreatico sporadico e di corrispondenti controlli negativi . L’obiettivo principale sarà identificare CNVs comuni a tutti i pazienti con cancro pancreatico sporadico. Questo set potrebbe essere usato per una diagnosi precoce e la scoperta di nuovi biomarkers per il trattamento del cancro pancreatico. Il nostro scopo sarà trovare geni associati al cancro, amplificati in tutti i pazienti con cancro pancreatico sporadico e geni oncosoppressori, deleti o presenti in singola copia, nel genoma degli stessi pazienti. Almeno 90-120 casi di adenocarcinoma pancreatico sporadico saranno studiati in accordo ai seguenti criteri di inclusione : CARATTERISTICHE DELLA MALATTIA : a) conferma istologica di adenocarcinoma pancreatico ; b) disponibilità di sangue periferico da pazienti affetti ; c) disponibilità di DNA da sangue periferico per analisi biomolecolari. CARATTERISTICHE DEI PAZIENTI : a) Età : superiore a 18 anni b) Sesso: maschi e femmine Saranno esclusi i pazienti con storia familiare di cancro pancreatico. Un consenso informato scritto sarà ottenuto da tutti i pazienti inclusi in questo studio. Tutte le informazioni cliniche relative a ciascun paziente saranno registrate in forma anonima. Da tutti i pazienti saranno prelevati 5 ml di sangue periferico che sarà processato per l’isolamento di leucociti periferici. Il sangue sarà centrifugato a 800 g per 20 minuti con l’uso di una Lympholyte Solution (Cedarlane). I leucociti saranno utilizzati per l’estrazione di DNA utilizzando un kit specifico (QIAamp® DNA Mini Kit, Qiagen ) e seguendo il protocollo fornito dal kit. Il DNA sarà preparato per l’ibridazione microarray usando il GeneChip Mapping Assay Protocol (Affymetrix Inc., UK Ltd, Europe). La genotipizzazione sarà eseguita con l’uso del GeneChip Human Mapping 500K Array Set (Affymetrix). Il database HapMap sarà usato come set di riferimento . Brevemente, 250 ng di DNA genomico totale sarà digerito con l’enzima NspI o StyI e ligato ad adattatori specifici che ibridano in regioni di 4 bp . Un primer generico che riconosce la sequenza dell’adattatore sarà usato per amplificare preferenzialmente frammenti di DNA legati all’adattatore aventi dimensioni di 250-2000 bp mediante condizioni di PCR ottimizzate. Il DNA amplificato sarà poi frammentato dall’enzima DNasi e ibridato all’ Affymetrix GeneChips Human Mapping 500K Set. L’ibridazione sarà rilevata usando coniugati streptavidina-ficoeritrina (SAPE) e seguita dalla scansione del probe array. Hybridization, washing, staining, e scansione del chip saranno eseguiti usando i protocolli forniti dalla Ditta Affymetrix Inc. Le immagini grezze saranno analizzate usando il GeneChip operating software (GCOS Ver1.4.1) and GTYPE (Ver4.1) software (Affymetrix). Noi escluderemo quei campioni con segnale di genotipizzazione (genotype call rate) < 93%. Per accertare le alterazioni nel numero di copie noi useremo il CNAT (Ver4.0.1) software. L’analisi dei dati consentirà di ottenere 2 liste contenenti gli SNPs con acquisizione (3 o più copie) o perdita di numero di copie (1 o 0 copie) .