analisi dei recettori implicati negli effetti indotti dalle purine sulle cellule muscolari lisce intestinali di mammifero

Nel presente progetto ci si propone di valutare ed analizzare, in preparati allestiti in vitro, il ruolo delle purine come neuromodulatori dell’attività meccanica ed elettrica di diversi segmenti dell’intestino di topo, i sottotipi di recettori coinvolti e i relativi meccanismi di trasduzione. Nei nostri studi verrà utilizzato come modello sperimentale il topo, sempre più un modello sperimentale importante per lo studio della motilità gastrointestinale grazie alla facilità con cui è possibile manipolare il suo genoma e quindi alla disponibilità di una grande varietà di mutanti. Dal momento che nostre precedenti ricerche hanno messo in luce il ruolo determinante svolto dalle purine nei meccanismi alla base del transito intestinale nel colon, priorità verrà data all’analisi dei recettori purinergici in tale porzione del tratto gastrointestinale. L’effetto indotto dall’ATP in tale regione è infatti mediato da recettori P2Y che presentano però un profilo farmacologico non sovrapponibili a quello di nessun purinocettore clonato. Verrà successivamente analizzato il contributo dato dalle purine nella trasmissione enterica a livello dell’ileo e valuteremo se anche in questo tratto del canale alimentare il riflesso peristaltico sia sostenuto dalla purine. Utilizzando agonisti stabili dell’ATP valuteremo il meccanismo di traduzione accoppiato ad ogni sottotipo di recettore servendoci di bloccanti e di attivatori dei canali ionici e di farmaci in grado di inibire la sintesi di messaggeri intracellulari. Inoltre, particolare attenzione sarà data ai meccanismi che consentono di modificare la concentrazione di calcio intracellulare che porterà alla variazione di distinte conduttanze ioniche e quindi alla risposta muscolare (eccitazione od inibizione). Prenderemo in considerazione anche la possibilità che diversi agonisti possano anche attivare differenti pathways legandosi ad uno stesso recettore (selettività funzionale) nel tentativo di caratterizzare i diversi recettori coinvolti nella neurotrasmissione enterica.

Gli obiettivi dle presente progetto sono: - - l’analisi del ruolo svolto e del meccanismo d’azione delle diverse purine (in particolare ATP e adenosina) nel controllo della funzione dell’intestino tenue e crasso di topo. - L’analisi dei meccanismo di traduzione, con particolare riguardo ai fattori che determinano la variazione della concentrazione di calcio intracellulare. - La valutazione della presenza dell'RNA messaggero (e delle proteine relative) dei diversi sottotipi recettoriali P2 nel tessuto intestinale murino mediante tecniche biologia molecolare. Inoltre sarà anche valutata la presenza di recettori orfani con caratteristiche strutturali correlate ai recettori P2Y: in particolare, sarà analizzata inizialmente la presenza degli mRNA di GPR17, GPR26, GPR34, che presentano, nei domini transmembrana 6 e 7, di residui aminoacidici critici per la specificità e affinità di legame dei nucleotidi. Tale ricerca prevede: - l’uso di tecniche di registrazione dell’attività meccanica in vitro di strips di muscolatura liscia di diverse porzioni del canale alimentare di topo, in particolare intestino tenue e colon. Le strips di muscolatura circolare o longitudinale saranno montate in un bagno per organo verticale, al fine di analizzare separatamente le risposte dei due strati muscolari. - l’uso di tecniche di registrazione dell’attività meccanica in vitro per l'analisi dell'attività perstaltica di segmenti intestinali. - l’uso di tecniche elettrofisiologiche (derivazione microelettrodica intracellulare) per la registrazione dei potenziali di membrana assoluti, dell’attività elettrica spontanea e delle risposte alla stimolazione di campo nei tessuti innervati, nonché delle risposte evocate dai diversi trattamenti sperimentali. L’attività elettrica intracellulare sarà rilevata con l’utilizzo di micropipette di vetro, riempite con KCl. -l’uso di tecniche di biologia molecolare quali la RT-PCR, e Western Blot per la valutazione dell’espressione nel tessuto dell’mRNA (e delle proteine relative) di diversi sottotipi recettoriali di interesse.