Analisi comparativa del ruolo delle connessine (Cx37, Cx39,Cx40, Cx43,Cx45) nel processo di rigenerazione del muscolo scheletrico di ratto

In un precedente studio, nell’ambito del progetto di Ateneo del 2005, abbiamo caratterizzato l’espressione spazio-temporale e cellulare della Cx39 durante il processo di rigenerazione del muscolo scheletrico adulto ed i risultati conseguiti (Belluardo, 2005b) hanno rivelato una espressione della Cx39 durante la fusione dei mioblasti per formare miotubi polinucleati e quindi miofibre contrattili. Nel presente progetto intendiamo effettuare uno studio comparativo di cinque connessine (Cx37, Cx39, Cx40, Cx43, Cx45) nello stesso modello sperimentale di lesione del muscolo scheletrico per permette una migliore comprensione del loro pattern di espressione e quindi del loro ruolo nella comunicazione di cellule miogeniche precursori durante il processo di rigenerazione muscolare. Per tale indagine saranno adoperati ratti adulti sottoposti a circoscritto trauma meccanico nel muscolo gastrocnemio ed a specifici intervalli di tempo dalla lesione (1, 2, 3, 5, 8, 9 giorni e 2, 3, 4, 6 settimane) i ratti saranno sacrificati e nel campione di muscolo lesionato prelevato sarà studiata l’espressione spazio-temporale e cellulare delle connessine mediante la tecnica della ibridazione in situ. Successivamente, per identificare le cellule che esprimono le connessine durante il processo di rigenerazione sarà adoperata la tecnica della doppia marcatura combinando la ibridazione in situ per le varie connessine e la immunoistochimica con specifici anticorpi come marcatori di proteine caratteristiche delle cellule della linea miogenica, come anti-miogenina e anti-desmina per i mioblasti, e anti-M-Caderina per le cellule satelliti. Infine, per distinguere l’espressione di connessine su cellule proliferanti e/o su cellule differenziate sarà effettuata una marcatura delle cellule proliferanti mediante somministrazione di bromodeossiuridina (BrdU) come descritto in materiale e metodi. Nell’insieme questo approccio di studio fornirà una analisi integrata del comportamento delle varie connessine con importanti informazioni sul loro ruolo ed interazione nelle varie fasi di rigenerazione muscolare.

Obiettivi Scopo del presente progetto è quello di comprendere attraverso uno studio comparativo il ruolo di un gruppo di cinque connessine (Cx37, Cx39, Cx40, Cx43, Cx45) nel muscolo scheletrico gastrocnemio di ratto adulto durante il processo di rigenerazione indotto da un circoscritto trauma meccanico. Metodologie Per lo studio saranno adoperati circa 40 ratti Wistar maschi adulti (280-300 g b.w.), sottoposti a circoscritto trauma meccanico nel muscolo gastrocnemio sotto profonda anestesia con cloralio idrato (50 mg/kg intraperitoneale). A specifici intervalli di tempo dalla lesione (1, 2, 3, 5, 8, 9 giorni e 2, 3, 4, 6 settimane) i ratti saranno sacrificati con un’overdose di anestetico e sarà prelevato il muscolo lesionato per essere successivamente processato per lo studio della espressione delle connessine. L’analisi di espressione spazio-temporale e cellulare delle connessine sarà effettuata mediante la tecnica della ibridazione in situ con specifiche ribosonde in grado di riconoscere in modo molto selettivo gli specifici RNAm senso presenti all’interno delle cellule. Le sonde sono già disponibili e la procedura da lungo tempo in uso nei nostri laboratori (Belluardo, 2005b). Per identificare le cellule che esprimono le connessine durante il processo di rigenerazione sarà adoperata la tecnica della doppia marcatura combinando la ibridazione in situ per le varie connessine e la immunoistochimica con specifici anticorpi come marcatori di proteine caratteristiche delle cellule della linea miogenica, come anti-miogenina e anti-desmina per i mioblasti, e anti-M-Caderina per le cellule satelliti. Questa tecnica di doppia marcatura è da lungo tempo in uso nei nostri laboratori (Belluardo, 2005b). Per l’analisi della espressione delle connessine su cellule in proliferazione o differenziate sarà utilizzata la tecnica della marcatura delle cellule proliferanti con la somministrazione intraperitoneale (40 mg/kg) di bromodeossiuridina (BrdU) che come analogo della timidina viene incorporata nel DNA in fase di duplicazione cellulare (fase S) e successivamente rivelata con procedura immunoistochimica con anticorpi anti-BrdU, come dettagliatamente descritto in precedenti lavori (Belluardo, 2005a). Combinando la ibridazione in situ per le connessine e la immunoistochimica per la BrdU sarà possibile identificare le cellule proliferanti che esprimono le connessine. Tutte le procedure tecniche e le apparecchiature necessarie sono in uso nei nostri laboratori.