Acetilazione di p53 e degli istoni nell’apoptosi indotta dagli inibitori delle deacetilasi istoniche in cellule tumorali umane

L’acetilazione rappresenta una modifica post-traduzionale importante nella regolazione della funzione della p53. E’ stato dimostrato, infatti, che l’acetilazione della p53, nella porzione carbossi-terminale, mediata dalle due diverse classi di coattivatori/acetiltransferasi CBP/p300 e pCAF/GCN5, aumenta la stabilità della proteina e la sua capacità trascrizionale. Nel nostro studio ci proponiamo di valutare il ruolo esercitato dalla p53 nell’apoptosi indotta da inibitori delle deacetilasi istoniche in cellule tumorali in coltura. Il nostro programma di ricerca prevede innanzitutto la valutazione, mediante esperimenti di Western blot, dello stato di acetilazione di p53 in assenza e in presenza di diversi inibitori delle deacetilasi istoniche (sodio butirrato, acido valproico, tricostatina, SAHA). Verranno utilizzati due diversi anticorpi diretti contro i residui di Lys acetilata 320 e Lys acetilata 373/382. I dati saranno comparati con l’effetto determinato sul livello della proteina p53. Essendo noto che p53 interagisce con numerose proteine capaci di regolarne la stabilità e la funzionalità, valuteremo mediante tecniche di immunoprecipitazione, l’interazione di p53 con Mdm2, pRb, le acetiltrasferasi istoniche p300 e pCAF, le deacetilasi istoniche (HDAC) e infine gli istoni nella forma acetilata. Gli studi saranno condotti sia in presenza che in assenza di inibitori delle HDAC (HDACI). Particolare interesse sarà rivolto all’analisi di un possibile complesso p53-p300, la cui produzione potrebbe risultare fondamentale per la successiva acetilazione degli istoni in particolari regioni del DNA e per l’attivazione di un set di geni apoptotici. Per dimostrare l’importanza di p53 nell’apoptosi indotta dagli HDACI, verrà impiegato il siRNA per p53. In particolare le cellule saranno trasfettate con un siRNA in grado di legare e degradare l’mRNA di p53, determinando quindi l’inibizione della traduzione di p53. Pertanto, nel caso in cui l’apoptosi sia dipendente da p53, la presenza del siRNA, agirà riducendo la morte cellulare indotta dagli HDACI. Inoltre, per dimostrare se il meccanismo apoptotico dipendente da p53 sia correlato con la sua attività trascrizionale, valuteremo l’effetto dell’introduzione nelle cellule di dominanti negativi di p53, che produrranno un tetrametro di p53, incapace di interagire come di norma con il DNA. Infine, per accertare l'eventuale ruolo della acetilazione di p53 nel meccanismo apoptotico, le cellule saranno trasfettate con plasmidi che codificano per p53 mutata nei siti di acetilazione 320 e 373. I plasmidi saranno ottenuti mediante procedure di mutagenesi sito specifica. Dopo trasfezione con i plasmidi codificanti p53 mutata, saranno valutate le modifiche nella composizione degli immunocomplessi di p53, nello stato di acetilazione degli istoni e nell’induzione dell’apoptosi.

Obiettivi Le nostre ricerche saranno condotte su diverse linee di cellule tumorali in coltura utilizzando diversi inibitori delle deacetilasi istoniche. Gli obiettivi della nostra ricerca possono essere così sintetizzati: 1. Accertare lo stato di acetilazione della p53 nel tempo, valutando, mediante impiego di specifici anticorpi, l’acetilazione a livello dei siti di serina 320 e 373/382. 2. Applicare tecniche di immunoprecipitazione della p53, valutando l’efficacia di diversi anticorpi anti-p53. 3. Accertare nell’immunoprecipitato la eventuale presenza dei seguenti fattori: MDM2, proteina che induce la ubiquitinazione e la successiva degradazione della p53; acetiltransferasi, in particolare la proteina CBP/p300, che interviene nella acetilazione della p53 a livello dei residui 373/382, e la proteina pCAF, correlata con l’acetilazione del residuo di lisina 320; e infine gli istoni H2A, H2B, H3 e H4. Sarà anche valutata negli immunoprecipitati la presenza della proteina del retinoblastoma p105. Gli studi saranno condotti tanto su cellule tenute in condizioni basali di coltura che su cellule trattate per vari tempi con il SAHA o con altri inibitori delle deacetilasi istoniche. L’obiettivo generale di questi studi è quello di stabilire se la p53 forma complessi nelle cellule con diverse strutture proteiche che ne possono modulare la funzione e se questi complessi vanno incontro a modifiche nella loro conformazione in seguito a trattamento con inibitori delle deacetilasi istoniche ed alla precoce acetilazione della p53. 4. Valutare il ruolo della acetilazione della p53 nell’induzione dell’apoptosi. A tal fine, mediante le tecniche riferite nella metodologia, si cercherà di stabilire se l’acetilazione della p53 è un evento che induce stabilizzazione dei complessi e attivazione della cosiddetta cascata di acetilazione con conseguente iperacetilazione delle componenti istoniche. In particolare, si cercherà di accertare se eventuali modifiche nella composizione dei complessi, indotte da HDACI, possano comportare variazioni nel loro assemblaggio a livello dei siti promoter dei geni target di p53, determinandosi così variazioni nella espressione degli stessi geni. Alternativamente, la p53 potrebbe, attraverso l’attivazione della cascata di acetilazioni, indurre l'espressione di geni apoptotici, mediante meccanismi, ancora da definire, che differiscono dai classici interventi trascrizionali della proteina. Questi studi potranno anche dimostrare se la p53 svolge nelle diverse cellule tumorali utilizzate un generale ruolo di induzione dell’apoptosi attraverso processi di acetilazione e se questi eventi comportano o meno intervento delle attività trascrizionali classiche della proteina. Metodologie Gli studi saranno condotti su linee cellulari umane di epatoblastoma HepG2, di epatocarcinoma Huh6 e HuH7, di carcinoma del colon retto HT29, di mieloma multiplo U266 e RPMI 8226, di carcinoma mammario MCF7. L’acetilazione di p53 sarà studiata impiegando diversi inibitori delle deacetilasi istoniche, quali SAHA, sodio butirrato, acido valproico, tricostastina ed anche ITF2357. Acetilazione di p53. Il livello di p53 acetilato sarà valutato mediante tecniche di Western blot, utilizzando specifici anticorpi che riconoscono p53 acetilata su residui di lisina 320 o lisine 373/382. Identiche quantità di proteine saranno sottoposte ad elettroforesi in gel di poliacrilammide in presenza di SDS, trasferite su filtro di nitrocellulosa mediante elettroblot e identificate mediante l'impiego di anticorpi specifici. L’analisi densitometrica dell’intensità delle bande sarà eseguita mediante IMAGE SXM 1.62 Software. Complessi di p53 con altre proteine. La produzione di questi complessi sarà valutata mediante esperimenti di immunoprecipitazione. Estratti totali, estratti nucleari e citosolici, ottenuti mediante un tampone di lisi (Nonidet p40, sodio deossicolato, sodio cloruro e inibitori de