Resistenza a stress cellulari di cellule staminali, differenziate ed embrionali

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La ricerca intrapresa riguarda lo studio dei meccanismi molecolari mediante i quali le cellule sottoposte a stress di varia natura (ambientali, infettivi, infiammatori) cercano di evitare danni cellulari che altrimenti potrebbero avviarle verso la morte cellulare.
Questo studio è affrontato in cellule staminali e cellule differenziate di topo e in un sistema embrionale modello (riccio di mare). Le cellule staminali possono subire severi danni cellulari nel momento in cui vengono recruitate in aree di tessuti danneggiati e in rigenerazione, dove vi sono citichine infiammatorie e cellule citotossiche. Esse devono avere dei meccanismi per resistere a questi stress. Pochè noi abbiamo trovato che le cellule staminali di topo della linea A6 sintetizzano, in condizioni di non stress, la proteina HSP70, nota come proteina di protezione della cellula, intendiamo approfondire i meccanismi molecolari che inducono la sua sintesi. Si indagherà sul/i fattore/i implicati nella attivazione della trascrizione basale del gene hsp70. Gli embrioni di riccio di mare rappresentano un importante anello della catena trofica di ambiente marino. In particolare essi sono molto vulnerabili agli stress indotti da agenti inquinanti, perché una perturbazione genica dei primi stadi può avere un enorme impatto sul loro sviluppo. Verrà valutata negli embrioni di riccio di mare l’influenza che vari agenti inquinanti (ioni di metalli pesanti) hanno sullo sviluppo embrionale, sia sul piano morfologico, che sul piano biochimico-molecolare. Ciò sarà analizzato mediante l’analisi della sintesi della proteina HSP70. In ambedue i casi, cellule staminali ed embrioni, verrà studiato il meccanismo di attivazione della trascrizione della proteina HSP70, mediante metodologie molecolari e biochimiche.

Base di partenza scientifica
Le cellule rispondono a stimoli ambientali avversi quali: concentrazioni tossiche di metalli pesanti, innalzamento di temperatura, variazione nei livelli di osmoliti, infezioni e malattie, aumentando l’espressione di specifici geni chiamati geni heat shock, la cui espressione gioca un importante ruolo nella protezione cellulare (Lindquist et al., Annu.Rev. Genet. 1998 22: 631-677). Le proteine heat shock sono classificate in differenti famiglie sulla base del loro peso molecolare e la più conservata fra tutte è la proteina HSP70, che infatti può essere usata come marker molecolare di stress (Mukhopadhyay et al., J. Biochem. Mol. Toxicol. 2003 17: 249-254). Le proteine da stress funzionano come chaperone molecolari riparando proteine danneggiate e mantenendole in uno stato di avvolgimento intermedio (Hartl, Nature 1996 381: 571-580). Le HSP70 inducibili dai vari stress sono infatti chiamate anche proteine della vita in quanto rendono le cellule resistenti all’apoptosi e alla azione di sostanze citotossiche. Le cellule staminali devono essere capaci, più di altre cellule, di sopravvivere a vari stress, poiché vengono recruitate in aree di tessuti danneggiati e in rigenerazione, dove citochine infiammatorie e cellule citotossiche possono produrre severi danni cellulari. Le proteine da stress giocano un ruolo nell’adattamento ambientale e questo può essere paticolarmente importante per gli organismi marini che vivono costantemente in ambienti che subiscono cambiamenti. In particolare gli embrioni di riccio di mare sono molto vulnerabili perché una perturbazione nell’espressione genica dei primi stadi può avere un enorme impatto sul loro sviluppo. La trascrizione dei geni heat shock ès otto controllo dei fattori di trascrizione heat shck (HSF). In particolare il fattore responsabile della sintesi inducibile, HSF1, in condizioni fisiologiche di crescita si trova sotto forma di monomero fosforilato, incapace di legare il DNA. In risposta allo stress termico o ad altri tipi di stress, HSF1 va incontro a trimerizzazione e a iperfosforilazione (Voellmy, Cell Stress e Chaperones 2004 9: 122-133).

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Obiettivi
L’obiettivo di questa ricerca è di chiarire il ruolo della proteina HSP70 che viene sintetizzata in assenza di stress nelle cellule staminali di topo della linea A6 e di chiarire inizialmente quale fattore sia implicato nella attivazione basale della trascrizione del gene hsp70. Si intende procedere con l’analisi dell’espressione episomale di un gene reporter sotto la guida del promotore del gene hsp70 inducibile, in condizioni normali di crescita e sotto stress (da calore e da trattamento con ioni cadmio). L’espressione episomale sarà paragonata con quella ottenuta dal gene reporter in cui le consensus dei fattori di trascrizione del promotore del gene Hsp70 sono state mutate. I dati ottenuti indicheranno uno o più fattori che maggiormente sono implicati nella trascrizione basale del gene hsp70 inducibile. I dati saranno validati da immunoprecipitazione della cromatina mediante anticorpi contro il fattore di trascrizione evidenziato dagli esperimenti precedenti, indicando inequivocabilmente se in vivo quel determinato fattore è legato alla consensus del DNA.
La risposta allo stress in embrioni di riccio di mare sarà analizzata sottoponendo gli embrioni a concentrazioni differenti di vari agenti inquinanti (ioni di metalli pesanti). Si valuterà la tossicità osservando la morfologia degli embrioni durante lo sviluppo e analizzando l’espressione della proteina HSP70 indicatore noto di stress cellulare.

Metodologie
Per l’espressione episomale verranno adoperati contemporaneamente due plasmidi: 1° plasmide contiene il gene reporter per la beta-galattosidasi, che è sotto il controllo del promotore del gene Hsp70 inducibile. Verranno adoperati anche plasmidi in cui il promotore del gene Hsp70 ha le sequenze delle consensus per i fattori di trascrizione modificate. 2° plasmide contiene il gene per la cloramfenicolo acetiltrasferasi (pCAT). Si procederà ad una doppia trasfezione nelle cellule staminali, linea A6 e in seguito nelle linee D16 e D351. I valori della attività della cloramfenicolo acetiltrasferasi saranno ottenuti dal taglio dell’Acetil-CoA radioattivo 14C. Essi verranno adoperati per misurare l’efficienza di trasfezione e per normalizzare i valori colorimetrici ottenuti dal taglio del substrato della beta-galattosidasi. I valori normalizzati indicheranno espressione della beta-galattosidasi, cioè indicheranno la capacità trascrizionale del promotore Hsp70 normale o modificato nelle varie consensus. I dati ottenuti dalla trascrizione episomale saranno confermati dalla immunoprecipitazione della cromatina. L’immuno precipitazione della cromatina in vivo è preceduta dalla fissazione DNA nativo con le proteine con cui interagisce. Dopo sonicazione della cromatina fissata si procederà all’immunoprecipitazione, utilizzando anticorpi specifici per i fattori di trascrizione di interesse. Infine con appositi primers si amplificheranno le regioni di DNA che contengono le consensus dei fattori di trascrizione presi in esame.
Lo sviluppo degli embrioni di riccio di mare, dopo trattamento con vari agenti inquinanti, sarà valutato mediante osservazione al microscopio ottico e fotografie degli stessi per esaminarne statisticamente la morfologia. La sintesi dell’HSP70 sarà valutata negli embrioni trattati e negli embrioni controllo, mediante osservazione al microscopio confocale facenso uso di anticorpi anti HSP70. La sintesi quantitativa sarà valutata tramite marcatura con metionina 35S esuccessive autoradiografie di elettroforesi mono e bidimensionali. Analisi western blot saranno utilizzate per valutare eventuali variazioni nelle isoforme di HSP70.
StatusActive
Effective start/end date1/1/05 → …

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