Immortalizzazione e caratterizzazione biomolecolare di una linea linfoblastoide derivata da un paziente con malattia di Prader-Willi

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La sindrome di Prader-Willi (PW) è una malattia genetica rara, caratterizzata da obesita’, ipotonia, ipogonadismo, iperfagia, ritardo mentale. In Italia sono noti circa 280 casi di PW con diagnosi confermata geneticamente, la sindrome è sicuramente sottodiagnosticata a causa della scarsa conoscenza della malattia. Le alterazioni genetiche alla base della PW sono abbastanza complesse e non del tutto note. La regione genomica implicata è la 15q11-q13 del cromosoma ereditato dal padre. Le alterazioni riscontrate sono diverse: 1) delezione della regione 15q11-q13, si riscontra in circa il 70% dei casi, il cromosoma che presenta la delezione è sempre quello paterno per cui mancheranno quei geni paterni normalmente funzionanti; 2) disomia uniparentale materna, è presente in circa il 28% dei casi, i cromosomi 15 sono ambedue di origine materna per cui manca comunque il contributo paterno; 3) mutazione del centro dell’imprinting. La metilazione del DNA gioca anche un ruolo fondamentale nel controllo di geni sottoposti ad imprinting genomico. Una caratteristica genetica della PW è che i geni non espressi sono di origine paterna determinando il fenomeno dell’imprinting genomico. La regione critica per la PW contiene numerosi geni multipli paternamente espressi ZNF127, NDN, SNURF/SNRPN, MAGEL2, MKRN3 e IPW. La Small Nuclear Ribonuclear protein subunita’ N è coinvolta nel processo dello splicing dell’RNA. Si è evidenziato come la SNRP subN sia prevalentemente espresse a livello cerebrale, dunque l’assenza di queste potrebbe essere correlata con la perdita di funzioni specifiche cerebrali (correlate con l'ipogonadismo e l'iperfagia). Si è evidenziato in circa il 70% dei pazienti PW la perdita di espressione della SNRPN (con imprint genomico essendo espressa solamente la copia paterna) dovuta o a delezione o a metilazione del promoter con conseguente silenziamento e perdita di espressione della copia paterna. La rarità della sindrome chiaramente non permette di avere spesso materiale cellulare per potere condurre studi in vitro. Linee cellulari linfoblastoidi immortalizzate mediante il virus di Epstein-Barr potrebbero costituire agevole modello in vitro che consentirebbe lo studio dell'espressione di geni coinvolti nel disturbi del comportamento alimentare e nell'obesità (ADIPOR2, MC2R, HCRT, OXTR) e nella steroidogenesi (STAR). Si procedera quindi all’immortalizzazione, mediante l’uso dell’Epstein-Barr Virus (EBV) di linfociti di un paziente con PW geneticamente accertata. Si procederà alla valutazione dell’integrazione del virus nel genoma linfocitario ed si valuterà l’espressione di antigeni virali, nonché della SNRPN e della necdina e di ADIPOR2, MC2R, HCRT, OXTR, STAR. Si procedera’ infine alla valutazione di dell'espressione di questi geni dopo coltura con agenti demetilanti (azacitidina) per valutare l’eventuale variazione di espressione genica dovuta alla demetilazione di specifiche sequenze.

Layman's description

L’uso di linee cellulari linfoblastoidi immortalizzate derivanti da pazienti con malattie genetiche rare può consentire di effettuare studi in vitro nonostante la scarsezza di materiale biologico e quindi fornire ai ricercatori nuove possibilità di studio. La sindrome di Prader-Willi è un malattia genetica rara, circa 280 casi in Italia, determinata da un meccanismo genetico particolare definito di imprinting genomico, in cui sono ad essere non espressi, perché deleti o metilati alcuni geni derivanti esclusivamente dal genitore padre e non dalla madre. La rarità della sindrome non consente di potere avere sufficiente materiale su cui potere effettuare studi in vitro. Per cui gli obiettivi del presente progetto di ricerca consistono nell’immortalizzare linfociti periferici di un paziente con PW mediante l’uso del virus di Epstein-Barr, di verificare l’avvenuata integrazione del genoma virale e la stabilizzazione della linea cellulare, e la successiva caratterizzazione della linea cellulare stessa, mediante cariotipo. In particolare si focalizzarà l’attenzione su diversi geni implicati nella genesi della malattia.. Si valuterà, mediante qRTPCR, l'espressione della SNRP e della necdina e se questa possa essere influenzata da agenti demetilanti (azacitidina). Si valuteranno mediante qRT-PCR l'espressione di geni coinvolti nel disturbi del comportamento alimentare e nell'obesità (ADIPOR2, MC2R, HCRT, OXTR) e nella steroidogenesi (STAR), recentemente emersi come deregolati in soggetti con PW. Linfociti da sangue periferico di un paziente con PW saranno isolati mediante gradiente discontinuo di Ficol-Hypaque, lavati e successivamente criopreservati. Aliquote scongelate saranno immortalizzate mediante infezione con Epsten-Barr virus (EBV) come descritto (). La coltura immortalizzata sarà sottoposta a gradienti di Ficoll e ripetutamente coltivata per permetterne la stabilizzazione. Il cariotipo sarà effettuato mediante colorazioni standard (bandeggio C, G). L’espressione della SNPRN sarà effettuata mediante RT-PCR. Brevemente, l’RNA sarà estratto da una coltura in fase logaritmica mediante il metodo di Chomzinsky e Sacchi e l’RNA ulteriormente purificato su colonna. Dopo avere valutato l’integrità mediante gel di agarosio, si quantizzerà allo spettrofotometro. Due microgrammi saranno retrotrascritti mediante l’uso di una retrotrascrittasi inversa e l’uso di random primers. Un microlitro verrà sottoposto a PCR con primers specifici per la SNRPN e per ADIPOR2, MC2R, HCRT, OXTR insieme ad un un gene di controllo. L’assenza della banda per la SNRPN è diagnostica per PW. Il test di metilazione verrà effettuato essenzialmente come descritto da (). Il DNA della linea verrà estratto mediante un sistema su colonna e trattato con sodio bisolfito per convertire le citosine non metilate in uracile. Dopo purificazione e precipitazione il DNA verrà sottosposto ad una PCR metilazione specifica (MSP) con primers specifici con l’uso del colorante fluorescente SYBR Green in maniera tale da potere seguire la reazione di PCR in real-time con l’uso del Lightcycler (Roche).
Analisi dell’integrazione del EBV. Verrà valutato il numero medio di copie per cellula di EBV mediante PCR quantitativa real time. Brevemente il DNA verrà estratto mediante un metodo su colonna e sottoposto a PCR real-time con adatti primers, ed il numero di copie verrà valutato mediante confronto con una curva standard. Saranno valutati l’espressione di antigeni EBV-specifici (EBNA, EA, VCA) mediante immunofluorescenza indiretta con adatti anticorpi monoclonali.
Valutazione degli effetti di agenti demetilanti.
Si valuterà l’effetto di un agente demetilante (5-azatimidina) sull’espressione della SNPR e della necdina e degli altri trascritti (ADIPOR2, MC2R, HCRT, OXTR) in cellule in coltura. L’RNA sarà estratto con un metodo su colonna e l’espressione si valuterà dopo retrotrascrizione,
StatusActive
Effective start/end date1/1/06 → …

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