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Description

Studi recenti suggeriscono che l'esposizione a differenti sostanze tossiche, come i metalli pesanti, possono determinare una cascata di eventi quali la produzione di specie reattive dell'ossigeno e danni ossidativi su tessuti.Fra i metalli pesanti, il cadmio è considerato un importante induttore di tossicità i cui potenziali effetti mutagenici, embriotossici e teratogeni, sono ancora oggetto distudio. Il cadmio è un naturale costituente delle rocce, del suolo(meno di 1 μg/g) e dell'acqua di mare(da 0,5 a 10 ng/L negli oceani o in mare aperto).Esso è presente in natura associato con lo zinco ed è un prodotto intermedio durante la purificazione industriale dello zinco. E' usato anche nella produzione di plastiche, nelle saldature, nell'industria mineraria, nella fabbrica di batterie e in forma solubile in parecchi colori utilizzati in pittura.Concentrazioni più elevate sono state riscontrate nelle coste, specialmente negli estuari, delle zone inquinate.Poiché è uno ione metallico permanente, non degradato da batteri o da detossificazione, viene accumulato in parecchi organismi, causando effetti tossici come:la produzione di specie reattive dell'ossigeno (Stohs,2001), la privazione del glutatione (Shimizu,1997), l'inibizione degli enzimi responsabili della sintesi e del riparo del DNA (Yang,1996), rotture su singolo filamento di DNA (Schroder,1999) e tossicità e carcinogenicità. Gli invertebrati superiori e i vertebrati, contro l'esposizione ai metalli pesanti, normalmente attivano sistemi di protezione incrementando l'espressione di proteine leganti i metalli,metallotioneine, e proteine heat-shock(Hsps) (Bauman,1993).L'aumento dell'espressione delle Hsps (Hsp70, Hsp60, Hsp27) inrisposta al cadmio è stata dimostrata in tessuti e cellule di parecchi organismi, per es.Drosophila(Courgeon,1984),nematodi(Guven,1995;Kammenga,1998), cellule umane (Polla,1995; Kim,2001), fegato di ratto (Curtis,1996). L'esposizione al cadmio induce anche apoptosi: nei tessuti di testicolodi ratto, fegato di topo, nelle cellule T umane (Xu,1996; Habeebu,1998; Tsangaris,1998) e nelle spugne marine (Wagner,1998; Schroder,1999).E' stato dimostrato che lo ione Zn è un potente inibitore/regolatore dell'apoptosi attraverso l'inibizione della caspasi-3 (Perry,1997) e Galan (2000) ha dimostrato che gli inibitori delle caspasi sono in grado di attenuare l'apoptosi indotta da cadmio. Durante l'apoptosi la permeabilità mitocondrialeè alterata (Dorta,2003) e specifici attivatori di proteasi sono rilasciati dagli organelli. La discontinuità della membrana esterna mitocondriale determina una ridistribuzione del citocromo c nel citoplasma, che ha per conseguenza la depolarizzazione della membrana interna (Bradham,1998).Il rilascio del citocromo c promuove l'attivazione delle caspasi tramite legame con Apaf-1, che attiva Apaf-3/ caspase-9 (Zou,1999), e questa attiva la caspase-3.Kondoh (2002) ha ipotizzato che l'apoptosi indotta da cadmio è in parte causata dall'attivazione della caspasi-9attraverso il citocromo c. Pertanto, l'apoptosi indotta da cadmio in parte dipende dai mitocondri, ma i meccanismi implicati non sono ancora stati chiariti. Recentemente è stato dimostrato che l'apoptosi causa unaradicale modificazione dell'espressione di molecole di membrana; un certo numero di lavori dimostra che la Hsp60, essenzialmentelocalizzata nella matrice mitocondriale di tutti i sistemi finora studiati, è espressa nella superficie cellulare di cellule tumorali, di cellule sottoposte a stress o cellule apoptotiche (Poccia,1996; elles,1999; Gupta,2002; Shin,2003).Ciò supporta l'ipotesi

Layman's description

Nella prima parte di questo programma ci occuperemo di indagare sull'effetto dell'accumulo di cadmio negli embrioni e nelle larve di Paracentrotus lividus. Pertanto incuberemo embrioni a diversi stadi di sviluppo con concentrazioni crescenti di cadmio e ne studieremo l'effetto sulla divisione cellulare con saggi di incorporazione di Timidina H3. Valuteremo, in collaborazione con l'unità di ricerca di Filosa, il reale accumulo di cadmio, mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico (AAS), misurando i residui rimanenti dalla mineralizzazione e/o combustione.PER STUDIARE LA SINTESI DELLE PROTEINE DA STRESS INDOTTE DA CADMIO: si cercherà di correlare l'eventuale disturbo morfologico con la sintesi proteica: embrioni e larve controllo e trattati con cadmio in continuo dalla fecondazione, a concentrazioni/tempi differenti, saranno in parte utilizzati per le osservazioni morfologiche, al microscopio ottico/interdifferenziale,e in parte incubati con aminoacidi radioattivi. Le proteine saranno separate per elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilamide, analizzate per autotoradiografia, al fine di identificare i diversi patterns di espressione. Analisi per Western blot,utilizzando anticorpi specifici contro proteine da stress che sono indotte da cadmio in altri sistemi (anti-Hsp70, -60, -27), ciconnsentiranno di studiare la eventuale modulazione delle Hsps in relazione all'accumulo del cadmio. Gli anticorpi contro le principali Hsps sono stati da noi precedentemente saggiati e utilizzati contro proteine di riccio di mare.PER STUDIARE L'EVENTUALE RECUPERO DEGLI EMBRIONI DOPO RIMOZIONE DEL CADMIO: gli embrioni verranno prima incubati con cadmio a concentrazione e tempi differenti, successivamente il cadmio sarà rimosso e gli ambrioni verranno fatti sviluppare in condizioni fisiologiche per 24/48 ore. La morfologia e il pattern di sintesi proteica verranno studiati come precedentemente descritto. Ciò ci consetirà di comprendere se l'effetto del cadmio sia reversibile e quali dosi e tempi di trattamento eventualmente interferiscano con lo sviluppo embrionale.PER STUDIARE LA HSP60: saggeremo, per Western blot, proteine di frazioni mitocondriali di embrioni e larve (controllo e trattate con cadmio) con l'anticorpo anti-Hsp60 umana, che, come da noi dimostrato, riconosce l'omologa, Hsp56, di riccio di mare. LaHsp56 è presente soltanto nella matrice mitocondriale, ha una specifica localizzazione territoriale durante lo sviluppo, ed è attivamente sintetizzata ed accumulata in risposta a shock termico (Roccheri et al,1997b; 2001). Esperimenti diimmunolocalizzazione con lo stesso anticorpo saranno effettuati per individuare la distribuzione territoriale della chaperonina in embrioni e larve interi (whole mount) e in sezioni di embrioni fissati; la distribuzione cellulare della Hsp56 verrà messa in evidenzaal microscopio elettronico, dopo marcatura con "immunogold" in collaborazione con il gruppo di Filosa.Lo stesso approccio sperimentale sarà utilizzato anche nelle cellule epiteliali mammarie tumorali e normali umane, incollaborazione con il gruppo di Luparello; in tessuti di Danio, Torpedo e Lacerta, e in linee stabilizzate CHO di criceto, incollaborazione con il gruppo di Filosa. Con questi esperimenti potremo verificare se la Hsp60 in seguito allo stress indotto da Cdmodifica la sua localizzazione trasferendosi sulle membrane cellulari, come recentemente descritto in alcuni sistemi, determinandol'avvio del processo apoptotico. La delocalizzazione dai mitocondri della Hsp60 potrebbe pertanto rappresentare un ottimomarcatore precoce di apop
StatusFinished
Effective start/end date11/30/0412/21/06