Cellule staminali di tumore mammario e nuovi traccianti per la diagnosi precoce.

Il tumore della mammella è ad oggi la neoplasia femminile più frequente nei paesi industrializzati, nonostante negli ultimi anni siano stati registrati significativi progressi sul versante della diagnosi precoce. Poiché le cellule staminali o cellule inizianti il tumore (CICs) rappresentano il nucleo del tumore e sarebbero responsabili della resistenza ai trattamenti chemioterapici convenzionali, risulta evidente l’importanza di identificare questa popolazione all’interno della massa tumorale. Le referenze bibliografiche hanno messo in evidenza che le cellule CD24low e CD44high hanno caratteristiche di staminalità e recentemente è stato identificato l’enzima ALDH1 come unico marcatore. Un approccio innovativo nella cura del carcinoma mammario consiste nell’evidenziare le caratteristiche di tali cellule che ne rispecchiano il particolare comportamento biologico per identificare gli aspetti molecolari che possano essere utilizzati come bersagli per strumenti diagnostici e di interventi terapeutici mirati. Diversi studi hanno dimostrato che in numerose neoplasie il processo tumorale origina da una deregolazione delle vie molecolari coinvolte nei principali processi di sviluppo tissutale durante l’embriogenesi, quali le vie di Wnt, Hedgehog e di Notch e recentemente è stato suggerito che queste vie di segnalazione svolgono un ruolo critico anche nelle cellule staminali di mammella. L’ipotesi che il carcinoma mammario sia il risultato della deregolazione di pathways che regolano il self-renewal delle cellule staminali normali porta a concludere che i componenti di questi pathways potrebbero rappresentare nuovi targets per lo sviluppo di terapie innovative. Date tali premesse, ci proponiamo di analizzare i profili di espressione e determinare i componenti delle suddette vie di trasduzione del segnale attivate in maniera aberrante nelle cellule staminali tumorali mediante tecniche avanzate di proteomica. Successivamente, l’obiettivo preposto è quello di bloccare la proliferazione delle cellule staminali tumorali mediante l’utilizzo di inibitori o antagonisti specifici dei bersagli identificati. Una volta identificate le proteine e i pathways biochimici coinvolti nella tumorigenesi, si effettueranno saggi in vitro e in vivo in modelli murini per indurre selettivamente la morte delle cellule staminali tumorali. Le capacità tumorigenica e metastatizzante delle CICs saranno analizzate mediante l’uso di tecniche di Imaging ottico in bioluminescenza. Questo approccio consente di localizzare in modo accurato e quantitativo i traccianti bioluminescenti all’interno di un organismo vivo monitorando la loro rapida distribuzione in un modo non invasivo e fornendo indicazioni fondamentali riguardanti la crescita e la migrazione spazio-temporale dell’ CICs marcate ed inoculate.

- Caratterizzazione delle cellule staminali tumorali da carcinomi mammari. Allo scopo di mettere a punto nuove strategie terapeutiche verranno raccolti numerosi pezzi tumorali di pazienti sottoposti ad interventi chirurgici per la rimozione della massa neoplastica. La diagnosi tumorale verrà stabilita in base alle caratteristiche istologiche peculiari. Si provvederà a raccogliere un’anamnesi precisa del paziente al momento dell’intervento e si provvederà a mettere a punto un appropriato programma di Follow-up che, attraverso periodici controlli clinici e strumentali, permetta di assegnare un valore prognostico alle cellule inizianti il tumore. - Studio dei principali pathways di trasduzione del segnale come Wnt, Hedgehog, Notch nelle cellule staminali tumorali versus le cellule tumorali differenziate. - Analisi del processo di metastatizzazione in vivo in modelli murini. L’insorgenza e la crescita delle metastasi rappresenta la principale causa di fallimento della terapia antineoplastica. Le cellule neoplastiche che riescono a dare origine a metastasi devono sopravvivere ad una serie di situazioni potenzialmente letali e originate dai sofisticati meccanismi che regolano la normale omeostasi dell’organismo. Mediante tecniche di bioluminescenza in modelli murini, si indagherà la tumorigenicità e la capacità metastatizzante delle cellule staminali tumorali epiteliali. A differenza dei traccianti “chimici” convenzionali (es. fluorescenti), infatti, quelli bioluminescenti hanno natura proteica che può essere codificata da vettori lentivirali e può essere rivelata dopo aggiunta dello specifico substrato. L’applicazione che giustifica maggiormente l’interesse per i traccianti bioluminescenti nell’ambito del presente progetto è quella del whole-body imaging: è stato dimostrato, infatti, che mediante tecniche di Imaging Ottico in bioluminescenza è possibile localizzare in modo accurato e quantitativo tali traccianti all’interno di un organismo vivente, permettendo di monitorare in tempo reale ed in modo non invasivo la loro distribuzione. - Ottenimento di campioni ottenuti da pezzi operatori di mammelle umane. I campioni verranno ottenuti da quadrantectomie e/o da mastectomie. - Purificazione delle CICs dai campioni tumorali di mammella. I pezzi operatori sono mantenuti in soluzione fisiologica per poche ore fino al processamento in PBS (Phosphate Buffer Saline) arricchito con antibiotico-antimicotico e incubati in ghiaccio per 16 ore. Segue la digestione enzimatica con ialuronidase e collagenase a 37°C per 2 ore e la centrifugazione differenziale per l’ottenimento dei fibroblasti e delle cellule epiteliali. Le cellule vengono tenute in condizioni di coltura differenziali a 37°C in incubatori con 5% CO2. La selezione e il mantenimento delle CICs avviene in fiasche a bassa aderenza in assenza di siero fetale bovino (FBS) e con una mix di ormoni di crescita come il fattore basico di crescita dei fibroblasti (bFGF) e il fattore di crescita dell’epidermide (EGF). - Tecnologia FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) mediante citometria a flusso. Si avvale dell’uso di anticorpi monoclonali specifici coniugati direttamente o indirettamente ad un fluorocromo. L’attività enzimatica di ALDH1 può essere rivelata mediante l’aggiunta del substrato (BAAA) alle cellule di mammella dissociate che lo metabolizzano in una forma altamente fluorescente che può essere evidenziata a 520-540 nm mediante citofluorimetria e sorter. Per saggiare la vitalità delle cellule si incuba solo con Propidio Ioduro. -Espressione di marcatori bioluminescenti. Le cellule sono infettate con vettori lentivirali esprimenti il cDNA della luciferase. In seguito all’aggiunta del substrato (luciferina) si valutano i livelli di espressione dell’enzima che converte, in maniera ATP-dipendente, il substrato con rilascio di luce nel campo del visibile. - Saggio di invasività